Статья по теме:
Анализ внутреннего пути апоптоза в эндотелиальных клетках под воздействием кальций-фосфатных бионов
Маркова В.Е., Шишкова Д.К., Кутихин А.Г., ФГБНУ «Научно-исследовательский институт комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний», г. Кемерово, Россия
Резюме
Цель. Изучить внутренний путь апоптоза в первичных артериальных эндотелиальных клетках в результате их экспозиции кальций-фосфатным бионам (КФБ).
Материалы и методы. Первичные эндотелиальные клетки коронарной артерии человека были экспонированы сферическим и игольчатым КФБ в течение 4 часов с последующим выделением общего белка и фракционированием органелл с разделением митохондриального и цитозольного белка. При помощи иммуноблоттинга определяли уровень митохондриального маркера потенциал-зависимого анионоселективного канала 1, цитозольного маркера глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и белков внутреннего пути апоптоза цитохрома с, HtгA2/Omi в митохондриях и цитозоле, а также уровень общей и активной каспазы-9 и каспазы-3 в общем белке, собранном с вышеуказанных культур эндотелиальных клеток в трех независимых экспериментах.
Результаты. Воздействие КФБ не всегда сопровождалось транслокацией данных белков из митохондрий в цитозоль. В зависимости от формы КФБ образцы выделенного из первичных артериальных эндотелиальных клеток белка различались как по спектру, так и по содержанию специфических белков. Лишь один эксперимент из трех показал стойкое повышение уровня активной каспазы-9 и каспазы-3 в экспонированных КФБ клетках в сравнении с контрольной группой (ФСБ), в товремя как в остальных каспазы либо детектировались нестабильно, либо уровень активных каспаз не различался между контрольной и опытными группами. Уровни общей и активной каспазы-9 и каспазы-3 характеризовались конкордантностью, что свидетельствует о прямой корреляции между данными апоптотическими ферментами.
Заключение. Представленные результаты показали неоднозначность механизмов эндотелиотоксического действия КФБ и необходимость дальнейшей расшифровки путей клеточной гибели под воздействием сферических КФБ и игольчатых КФБ, а также необходимость совершенствования методики оценки молекулярных путей клеточной гибели под воздействием КФБ.
Ключевые слова: кальций-фосфатныебионы, фосфат кальция, гидроксиапатит, эндотелиальные клетки, апоптоз, каспазы.
Abstract
ORIGINAL RESEARCHANALYSIS OF INTRINSIC APOPTOSIS IN ENDOTHELIAL CELLS EXPOSED TO CALCIUM PHOSPHATE BIONS
Victoria E. Markova , Daria K. Shishkova, Anton G. Kutikhin, Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases, Kemerovo, Russian Federation
Aim. To study intrinsic apoptosis in primary arterial endothelial cells treated with calcium phosphate bions (CPB).
Materials and Methods. Primary human coronary artery endothelial cells were exposed to spherical or needle-shaped CPB during 4 hours with the subsequent extraction of total protein and subcellular fractionation to separate mitochondrial and cytosolic protein. We then performed Western blotting to measure the relative levels of a mitochondrial marker porin, cytosolic marker glycer- aldehyde 3-phosphate dehydrogenase and intrinsic apoptosis proteins cytochrome c and HtrA2/Omi in mitochondria and cytosol in addition to the levels of total and cleaved caspases-9 and caspases-3 in the total protein collected from three independent experiments.
Results. Translocation of cytochrome c and HtrA2/Omi was not a mandatory consequence of CPB exposure. Relative levels of the measured proteins differed according to the particle shape. Out of three experiments, only one showed a significant increase in cleaved caspase-9 and caspase-3 in CPB-treated as compared with the mock-treatedcells. In other experiments, cleaved caspases did not show a consistent elevation. The levels of total and cleaved caspase-9 and caspases-3 were concordant testifying to the direct correlation between them.
Conclusion. As mechanisms of CPB-induced endothelial toxicity are poorly defined, they require further investigation employing optimised methods.
Keywords: calcium phosphate bions, calcium phosphate, hydroxyapatite, endothelial cells, apoptosis, caspases.
Введение
Кальций-фосфатные бионы (КФБ) являются минерало-органическими наночастицами, состоящими из гидроксиапатита, карбонат-гидроксиапатита и кислых белков сыворотки крови, в том числе альбумина и фетуина-А [1]. Снижение уровня альбумина в крови приводит к увеличению концентрации ионизированного кальция (Са2+), что, в свою очередь, стимулирует формирование КФБ в организме человека.
Биологический смысл образования КФБ в крови заключается в поддержании фосфорно-кальциевого гомеостаза, поскольку данные частицы наряду с кальций-протеиновыми мономерами являются одним из основных депо избыточного кальция и фосфора в системном кровотоке [2]. КФБ собственно абсорбируют ионы кальция (Са2+) и фосфат-анионы (Р043-), предотвращая пассивную внескелетную кальцификацию, и далее выводят из кровотока после интернализации эндотелиальными клетками крупных артерий и микроциркуляторного русла внутренних органов, в особенности печени и селезенки [3, 4]. В то же время, препятствуя развитию эктопической минерализации, КФБ вызывают дисфункцию эндотелия, стимулируя выделение провоспалительных цитокинов и экспрессию молекул клеточной адгезии на поверхности эндотелиальных клеток [5, 6]. В конечном счете дисфункция эндотелия приводит к миграции моноцитов в интиму и их последующей диффе- ренцировке в макрофаги, а также к нарушению паракринных взаимодействий между эндотелиальными и сосудистыми гладкомышечными клетками [7].
При формировании КФБ претерпевают некоторые физико-химические изменения. Из изначально аморфной структуры происходит переход в кристаллическую, таким образом, из сферических КФБ (СКФБ) образуются игольчатые КФБ (ИКФБ). Есть предположение, что умеренное перенасыщение крови кальцием и фосфатами приводит к образованию СКФБ, в то время как тяжелое перенасыщение сопоставимо с появлением ИКФБ [8]. Форма КФБ, как и наночастиц гидроксиапатита, во многом определяет их токсичность - ИКФБ вызывают гибель большей доли клеток в культуре в сравнении с СКФБ [9-11]. На молекулярном уровне сферические и игольчатые КФБ имеют различное патогенное воздействие на эндотелиальные клетки. В частности, СКФБ усиливают выделение клетками эндотелия интерлейкина-1в, а ИКФБ - фактора некроза опухоли-а, что может указывать на активацию СКФБ инфламмасомного пути вследствие первичного повреждения лизосом [4].
Известно множество путей клеточной гибели. Лизосомально-опосредованный путь связан с повышением проницаемости мембран лизосом и высвобождением нарушающих гомеостаз в цитозоле и на внешней мембране митохондрийкатепсинов (лизосомальныхцистеиновых, аспартатных или сериновых протеаз); кроме того, при растворении фосфата кальция это ведет к высвобождению Са2+, что также приводит к повышению проницаемости внешней мембраны митохондрий вследствие массивного перехода Са2+ из цитозоля в митохондрии [1215]. Внутренний путь апоптоза, в свою очередь, опосредован повышением проницаемости внешней мембраны митохондрий и запуском каскада реакций, в конечном итоге связанным сактивацией каспаз (цистеин-зависимые аспар- тат-специфичные протеазы) [12]. Данный путь клеточной гибели связан с выделением в цитозоль из межмембранного пространства митохондрий про-апоптотических белков цитохрома С, HtгA2/Omi и SMAC/DIABLO [12]. Связываясь с активирующим фактором апоптотических протеаз (APAF-1), цитохром с запускает его гептамеризацию в результате гидролиза и замещения дАТФ [16-18]. Это приводит к формированию апоптосомного комплекса, который связывает и рассекает прокаспазу-9, таким образом активируя ключевую каспазу внутреннего пути апоптоза [18-20]. Связываясь с прокаспазой-3, инициирующая каспаза-9 в конечном итоге, активирует эффекторную каспазу-3 [2123], что ведет к формированию молекулярной петли положительной обратной связи между каспазой-3 и каспазой-9, усиливающей активацию обеих данных молекул [24]. Одновременно с этим HtгA2/Omi и SMAC/DIABLO связываются с Х-связанным ингибитором апоптоза (Х1АР), инактивируя его и высвобождая ка- спазу-9 и каспазу-3 [25-30]. Каспаза-3 далее способствует фрагментации ДНК, инактивируя альфа-субъединицу фактора фрагментации ДНК (DFFA) и таким образом высвобождая бета-субъединицу данного белка (каспаза-активи- руемуюДНКазу) [31-33]. Фрагментация ДНК, в свою очередь, ведет к р53-опосредованной клеточной гибели [33].
В то время как лизосомально-опосредован- ный путь клеточной гибели эндотелиальных клеток при воздействии КФБ был изучен нами ранее, реализация внутреннего пути апоптоза в этом патогенетическом сценарии остается неясной. В связи с этим целью данного исследования стало детальное изучение внутреннего пути апоптоза в первичных артериальных эндотелиальных клетках в результате их экспозиции КФБ.
Цель исследования
Изучить внутренний путь апоптоза в первичных артериальных эндотелиальных клетках в результате их экспозиции кальций-фосфат- нымбионам (КФБ).
Основная часть
клетка бион кальций гибель
Материалы и методы
Искусственный синтез бионовСКФБ были синтезированы путем последовательного добавления 9,9 мкл 0,5М СаС12 ^щта-АЫпсЬ1, 21115) и 21,5 мкл 0,2МNa2HPO4 (Sigma-Aldrich, 94046) в 1320 мкл среды Игла, модифицированной по Дульбек- ко (DMEM, Gibco, 41966029), содержащей 150 мкл (10% от общего объема) фетальной телячьей сыворотки (Gibco, 10500056). Игольчатые КФБ (ИКФБ) были синтезированы при помощи последовательного добавления 16,5 мкл CaCl2 (0,5 моль/л, Sigma-Aldrich, 21115) и 37,5 мкл Na2HPO4 (0,2 моль/л, Sigma-Aldrich, 94046) в 936 мкл среды DMEM, содержащей 10 мкл (1% от общего объема) фетальной телячьей сыворотки (Gibco, 10500056). Для синтеза СКФБ содержание солей в среде после их добавления составляло 3 ммоль/л, для синтеза ИКФБ - 7,5 ммоль/л. Контроль pH осуществлялся путем предварительного добавления 5 мл N-2-ги- дроксиэтилпиперазин-^2-этансульфокислоты (Gibco, 15630056) к 495 мл культуральной среды DMEM (финальная концентрация в среде - 1%). В целом искусственный синтез бионов соответствовал ранее разработанным оригинальным протоколам [34, 35].
После кратковременного перемешивания на вортексе пробирки объемом 1,5 мл (Eppendorf) с реагентами для синтеза бионов были инкубированы при +37°С, 5% CO2 и высокой влажности (MCO-18AIC, Sanyo) в течение 24 часов с дальнейшим центрифугированием при 200,000 x g и +4°С в течение 1 часа (Optima MAX-XP, BeckmanCoulter) для осаждения бионов всего спектра размерности. С целью получения рабочего раствора осадок СКФБ растворялся в 1000 мкл, а осадок ИКФБ - в 1500 мкл однократного фосфатно-солевого буфера (ФСБ, pH 7,4, Gibco, 10010023), что позволяло достичь мутности суспензии в 0,5 стандарта МакФарланда (МкФ), являющейся минимально измеримой величиной концентрации бионов в растворе.
Все вышеуказанные процедуры проводили в стерильных условиях. Измерение оптической плотности проводили на микропланшетном спектрофотометре «Униплан» (АИФР-01, Пикон) на длине волны 650 нм (ОП650, мутность суспензии 0,5 МкФ соответствовала значениям ОП650 = 0,08 - 0,10).
Культивирование эндотелиальных клеток
Для экспериментов были использованы коммерческие культуры первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии человека (HCAEC, CellApplications, 300K-05a). Согласно информации поставщика, первичные эндотелиальные клетки человека были получены из здоровых артерий доноров с криоконсервацией на2-м пассаже (500,000 клеток в базальной среде MesoEndoCellBasalMedium (CellApplications, 212K-500), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида. Для проведения эксперимента клетки размораживали и культивировали в культуральных флаконах Т-75 (TechnoPlasticProducts, 90076) согласно рекомендациям производителя в среде для роста клеток MesoEndoCellGrowthMedium(CellApplications, 212-500). Пересев производили по достижении 80% конфлюэнтности. На 6-м пассаже клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты (TechnoPlasticProducts, 92696) для проведения дальнейших экспериментов. Все эксперименты с клетками проводили в стерильных условиях при 37°C, 5% CO2 и высокой влажности.
Фракционирование органелл и выделение белка
Белки, регулирующие клеточную гибель, находятся в различных клеточных органеллах. В связи с этим было решено провести фракционирование органелл с целью выделения обогащенных фракций белков. После культивирования первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии до 85-90% они были собраны с культурального флакона путем обработки трипсином в течение 5 минут и центрифугирования в смеси трипсина с нейтрализующим раствором (CellApplications, 090K, соотношение 1:4) при 220 х g в течение 5 минут. Следующим этапом было проведение собственно фракционирования клеточных органелл (митохондрии, ядро, цитозоль) и выделение из них белка с помощью специального набора компании Abcam (ab109719) в соответствии с инструкцией производителя.
Параллельно проводился эксперимент по выделению общей белковой фракции. После экспозиции культивированных до 85-90% кон- флюэнтности первичных эндотелиальных клеток коронарной и внутренней грудной артерии в течение 4 часов, было произведено выделение белка RIPA-буфером (ThermoScientific, 89901) с ингибиторами протеаз и фосфатаз (ThermoScientific, 78444) в соответствии с инструкцией производителя (500 мкл RIPA-буфера на флакон, лизис клеток в течение 5 минут на льду, сбор лизата, центрифугирование при 14 000 х g в течение 15 минут при 4°С). Для первичных эндотелиальных клеток коронарной артерии эксперимент ставился дважды в целях повышения его воспроизводимости.
Измерение белка во всех полученных образцах проводилось при помощи набора Pierce BCA ProteinAssayKit (ThermoScientific, 23225) в соответствии с инструкцией производителя на спектрофотометре (MultiskanSky, ThermoScientific) и длине волны 562 нм. Принцип действия указанного набора основан на восстановлении Cu2+ до Cu+ белками в щелочной среде с последующей колориметрической детекцией Cu+ бицинхониновой кислотой (BCA). Белок замораживали и хранили при -60°С. Далее белок замораживали и хранили при -60°С.
Иммуноблоттинг
Одинаковые количества белка (10 мкг для митохондриальной и цитозольной фракций и 21 мкг для общей белковой фракции) смешивали с буфером для денатурации белка NuPAGE LDS SampleBuffer (Invitrogen, NP0007) в отношении 4:1 и восстановителем NuPAGESampleReducingAgent (Invitrogen, NP0009) в отношении 10:1 и загружали на 10-луночный гель NuPAGE 4-12% Bis-Tris толщиной 1,5 мм (Invitrogen, NP0335). В качестве маркеров молекулярных масс загружали смесь белковых стандартов NovexSharpPre-StainedProteinStandard (Invitrogen, LC5800) и MagicMark XP WesternProteinStandard (Invitrogen, LC5602) в соотношении 1:1 (5:5 мкл). Разделение белков проводили электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия в буфере NuPAGE MES SDS RunningBuffer (Invitrogen, NP000202) при 150 В в течение 1 часа. Перенос белка осуществляли при помощи наборов для сухого переноса, содержащих мембрану из поливинилиденфторида (Invitrogen, IB24001), и прибора для сухого переноса iBlot 2 (Invitrogen) в соответствии со стандартным протоколом производителя (P0, 7 минут). Блокировку неспецифического связывания осуществляли при помощи набора iBindFlexSolutionKit (Invitrogen, SLF2020) в течение 1 часа.