Статья: Анализ содержания аминокислот в образцах животного и растительного происхождения методом ионообменной хроматографии с постколоночной дериватизацией

Таблица 2. Содержание аминокислот в образцах животного происхождения в граммах на 100 г исходного образца (без удаления жира), среднее по 3 испытаниям (пробоподготовка проводилась без окисления образцов)

Table 2. The content of amino acids in samples of animal origin in grams per 100 g of original sample (without fat removal) on average over 3 tests (sample preparation was carried out without sample oxidation)

Рис. 4. Хроматограмма разделения пробы, полученной из образца семян люпина узколистного массой 1 г с разведением 1:2 (1) и 1:4 (2).

Fig. 4. Chromatogram of the separation of the test obtained from a sample of seeds of angustifolia lupine weighing 1 g with a dilution of 1:2 (1) and 1:4 (2).

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Таблица 3. Содержание аминокислот в образцах семян бобовых в граммах на 100 г исходного образца Table 3. Content of amino acids in samples of legume seeds in grams per 100 g of the initial sample

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Таблица 4. Содержание аминокислот в образцах растительного происхождения в граммах на 100 г сухого образца

Table 4. The content of amino acids in samples of plant origin in grams per 100 g of dry sample

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Присутствие метионина в исходной форме обусловлено неполным его окислением ввиду крупного размера частиц образца. В настоящее время проводится размол до размера частиц не более 0,5 мм.

Кроме высокой концентрации аминокислот это может свидетельствовать о низкой емкости используемого типа колонок (рис. 5).

Рис. 5. Признаки перегрузки хроматографической колонки Sevko (выраженный наклон пиков в направлении тыла хроматограммы) при анализе пробы с концентрацией глутамина ~0,5 мкМоль/мл, глицина --0,23 мкМоль/мл.

Fig. 5. Signs of overloading the Sevko chromatographic column (pronounced slope of the peaks towards the rear of the chromatogram) when analyzing a sample with a concentration of glutamine ~0,5 мmol/ml, glycine --0,23 мmol/ml.

Источник: составлено автором. Source: compiled by the author.

Заключение

Проведенные испытания показывают, что важной задачей при подготовке проб к анализу на содержание аминокислот в описанных условиях хроматографирования является правильная оценка концентрации аминокислот в пробе и соответствующая подготовка пробы перед вводом в хроматографическую систему.

В общем случае рекомендуется разведение проб, полученных из растительных образцов, вдвое, из животных и растительных образцов с высоким содержанием белка (например, семена бобовых) - вчетверо для получения качественных хроматограмм.

Тем не менее, желательно проводить пробное разделение, по результатам которого принимать решение о разведении подготовленных проб.

Чувствительность метода достаточна для количественного определения аминокислот вплоть до 0,01 мкМ/мл (соотношение S/N сохраняется на уровне 9-10), при этом предел обнаружения составляет порядка 0,0001 мкМ/мл (соотношение S/N при этом - 2,12).

Все параметры, такие как максимальная концентрация, при которой аминокислоты разделяются полностью, времена удерживания (и др.) проверены в испытаниях на двух аналогичных хроматографических Na-ионообменных колонках Sevko.

Список источников

1. Otter D.E. Standardised methods for amino acid analysis of food // British Journal ofNutrition. 2012. 108(2). P. 203-237.

2. Toomer O.T. et al. Feeding high-oleic peanuts to meat-type broiler chickens enhances the fatty acid profile of the meat produced // Poultry Science, Elsevier Inc. 2020. 99(4). P. 2236-2245. doi:10.1016/ j.psj.2019.11.015

3. Sherwood R.A. Amino acid measurement by high-performance liquid chromatography using electrochemical detection // Journal of Neuroscience Methods. 1990. 34. P. 17-22. doi:10.1016/0165- 0270(90)90037-g

4. Joseph MH., Davies P.T. Electrochemical activity of o-phthalaldehyde-mercaptoethanol derivatives of amino acids. Application to high-performance liquid chromatographic determination of amino acids in plasma and other biological materials // Journal of chromatography 1983. Vol. 277. P. 125-136.

5. Brent R.L., Frederick GW. A method for quantitative amino acid analysis using precolumn o-phthalaldehyde derivatization and high performance liquid chromatography // Journal of Chromatographic Science. 1981. Vol. 19(5). P 259-265.

6. Tcherkas Y.V., Denisenko A.D. Simultaneous determination of several amino acids, including homocysteine, cysteine and glutamic acid, in human plasma by isocratic reversed-phase high-performance liquid chromatography with fluorimetric detection // Journal of Chromatography. 2001. Vol. 913(1-2). P. 309-313. doi:10.1016/s0021-9673(00)01201-2

7. Albin D.M., Wubben J.E., Gabert V.M. Effect ofhydrolysis time on the determination of amino acids in samples of soybean products with ion-exchange chromatography or precolumn derivatization with phenyl isothiocyanate // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2000. Vol. 48(5). P 1684-1691.

8. Sato K. et al. Improved method for identification and determination of .epsilon.-(.gamma-glutamyl)lysine cross-link in protein using proteolytic digestion and derivatization with phenyl isothiocyanate followed by high-performance liquid chromatography separation // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 1992. Vol. 40(5). P 806-810.

9. Kang X. et al. Optimization of dansyl derivatization and chromatographic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samples // Clinica Chimica Acta. 2006. Vol. 366(1-2). P 352-356. doi:10.1016/j.cca.2005.11.011

10. Zhou W., Zhang X.Y., Duan G.L. Liquid-chromatography quantitative analysis of 20 amino acids after derivatization with FMOC-CI and its application to different origin Radix isatidis // Journal of the Chinese Chemical Society. 2011. Vol. 58(4). P 509-515.

11. Friedman M. Applications of the ninhydrin reaction for analysis of amino acids, peptides, and proteins to agricultural and biomedical sciences // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2004. Vol. 52(3). P. 385-406.

12. Sharma G. et al. Analysis of 26 amino acids in human plasma by HPLC using AQC as derivatizing agent and its application in metabolic laboratory // Amino Acids. 2014. 46(5). P 1253-1263.

13. Захарова А.М., Гринштейн И.Л., Карцова Л.А. Определение аминокислот в сухом экстракте мозга коров, пробах мяса телят и кур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии // Сорбционные и хроматографические процессы. 2012. Т 12. N° 6. С. 845-853.

14. Molnar-Perl I. Advances in the analysis of tryptophan and its related compounds by chromatography // In: Huether G. et al. (eds.) Tryptophan, serotonin and melatonin: basic aspects and application. 1999. P. 801-816.

15. Yust M.M. et al. Determination of tryptophan by high-performance liquid chromatography of alkaline hydrolysates with spectrophotometric detection // Food Chemistry. 2004. Vol. 85(2). P. 317-320.