2. Реакция торможения гемагглютинации - РТГА. Ее принцип состоит в том, что при контакте вируса с гомологичными антителами происходит связывание антител с гемагглютининами вируса, в результате чего вирус теряет свойство агглютинировать (склеивать) эритроциты. Для этого исследуемую сыворотку в разных разведениях смешивают с одинаковыми дозами известного вируса и после контакта ко всем смесям добавляют суспензию эритроцитов, которые служат индикатором вирусных гемагглютининов. При высшем разведении исследуемой сыворотки, когда еще подавляется гемагглютинация, и определится титр антител в этой сыворотке.
3. Реакция непрямой гемагглютинации - РНГА. Ее принцип состоит в том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы вирусы, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных антител, содержащихся в исследуемой сыворотке крови. РНГА позволяет обнаруживать и титровать антитела. За титр антител в сыворотке крови принимают наибольшее ее разведение, которое вызывает агглютинацию сенсибилизированных вирусом эритроцитов. РНГА можно поставить макро- и микрометодами.
4. Реакция связывания комплемента (РСК). На первом этапе в реакции участвуют антиген и антитело, а также определенное количество предварительно оттитрованного комплемента. При соответствии вирусного антигена и специфического к нему антитела образуется комплекс, и он связывает комплемент, что выявляют на втором этапе с помощью индикаторной системы, состоящей из бараньих эритроцитов и гемолитической сыворотки кролика. Если комплемент связался при взаимодействии вирусного антигена и специфических к нему антител, то лизис (растворение) бараньих эритроцитов не происходит, что свидетельствует о положительной РСК. При отрицательной РСК несвязанный комплемент способствует гемолизу эритроцитов, по которому судят о результатах реакций.
5. Реакция диффузной преципитации (РДП) основана на способности специфических антител сыворотки крови и специфических растворимых вирусных антигенов диффундировать в толще агарового геля навстречу друг другу, в результате чего образуется комплекс “антиген+антитело”. Этот комплекс не обладает способностью диффундировать в агар и выпадает в осадок на месте образования в виде полосы преципитации, видимой невооруженным глазом. Если же антитела и антиген не соответствуют (негомологичны) друг другу, то полосы преципитации не образуются, что свидетельствует об отрицательной РДП.
6. Реакция торможения гемадсорбции (РТГАд) основана на торможении гемадсорбции, если зараженную вирусом культуру клеток предварительно обработать специфической сывороткой, содержащей антитела к этому вирусу. Она позволяет идентифицировать гемагглютинирующий вирус в культуре клеток намного раньше появления отчетливых цитопатических изменений в пораженных вирусом клетках.
7. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ). Ее сущность состоит в обработке препаратов-отпечатков из патологического материала сывороткой крови, содержащей специфические антитела к определенному вирусу и обработанной флуорохромом (веществом, способным светиться при облучении светом). Если вирусный антиген и меченая сыворотка, содержащая специфические к данному вирусу антитела, соответствуют друг другу, то происходит образование комплекса "антиген+антитело", и он обнаруживается с помощью люминесцентного микроскопа по специфическому свечению. Наибольшее распространение получила реакция прямой иммунофлюоресценции.
8. Иммуноэлектронная микроскопия (аналог предыдущего метода) позволяет идентифицировать различные виды вирусов, выявленные электронной микроскопией (например, различные виды герпесвирусов), что невозможно сделать, основываясь на морфологических особенностях. Вместо антисывороток для идентификации используют помеченные разными способами антитела, но сложность и дороговизна метода ограничивает его применение.
9. К методам, основанным на принципе использования меченых антител, относится иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Принцип метода состоит в обнаружении антигена, фиксированного на носителе, специфическими глобулинами, мечеными ферментами (пероксидаза хрена, кислая или щелочная фосфатаза). Фермент проявляют различными субстратами, дающими с ним характерное окрашивание, которое определяют фотометрическим методом.
10. Радиоиммунный метод основан на использовании меченого радиоактивным йодом антигена. Антиген, соединяясь с антителом, образует меченый иммунный комплекс антиген-антитело. Результат определяют на счетчике.
11. Метод иммуноэлектрофореза основан на способности антигенов и антител диффундировать в геле под действием электрического поля.
12. Торможение цитопатического эффекта интерференцией вирусов. Реакцию торможения цитопатического эффекта за счет интерференции вирусов применяют для идентификации возбудителя, интерферирующего с известным цитопатогенным вирусом в культуре чувствительных клеток. Для этого в культуральную среду, содержащую изучаемый вирус, вносят коммерческую сыворотку (например, к вирусу краснухи при подозрении на нее), инкубируют и заражают вторую культуру; через 1-2 дня в нее вносят известный цитопатогенный вирус (например, любой ЕСНО-вирус). При наличии цитопатогенного эффекта делают вывод о том, что первая культура была заражена вирусом, соответствовавшим применённым антителам.
Семейство Orthomyxoviridae (от греч. orthos - правильный, прямой и myxa - слизь) объединяет группу вирусов, которые имеют особое сродство к мукополисахаридам и гликопротеидам клеточных рецепторов, а также сходные биологические свойства (способность агглютинировать эритроциты, тропизм к органам дыхания, легкость культивирования в куриных эмбрионах, наличие гемагглютинина, а у некоторых вирусов – также и нейраминидазы).
Классификация. Согласно международной таксономии вирусов, семейство Orthomyxoviridae включает четыре рода: Influenzavirus А, Influenzavirus В, Influenzavirus С и Togotovirus.
Род Influenzavirus А включает один вид - вирус гриппа А. Этот вирус открыли В. Смит, С. Эндрюс и П. Лейдлоу в 1933 г. Внутри этого вида различают субтипы вируса по гемагглютинину и нейраминидазе. Внутри субтипов могут быть сероварианты. Номенклатура вновь выделенных изолятов вируса гриппа А складывается из следующих критериев: род/хозяин/место выделения/обозначение штамма/год выделения/формула (тип гемагглютинина Н и нейраминидазы N), например, А/крачка/ Южная Африка/1/61/(Н5N3).
Род Influenzavirus В включает один вид - вирус гриппа В, который выделили Т. Фрэнсис и Р. Меджилл в 1940 г. У него в отличие от вируса гриппа А не установлены антигенные субтипы. Вирусы гриппа В обозначаются по следующим критериям: род/место выделения/обозначение штамма/год выделения.
Род Influenzavirus С также включает один вид - вирус гриппа С, который открыл Р. Тэйлор в 1947 г. Данный вид инфицирует только людей. Антигенных субтипов у вируса гриппа С не отмечено. Чаще всего вирусы гриппа С вызывают инфекцию у детей в виде отдельных спорадических вспышек.
Род Togotovirus включает 2 вида, из которых вирус Togoto является прототипным. Тоготовирусы передаются между позвоночными через клещей.
Морфология вирионов. Геном ортомиксовирусов представлен односпиральной линейной фрагментированной молекулой минус-РНК. Количество фрагментов в геноме различных представителей ортомиксовирусов разное. Так, вирусы гриппа А и В имеют 8 фрагментов, вирусы гриппа С – 7 фрагментов; тоготовирусы - 6 фрагментов. Каждый фрагмент в отдельности и все фрагменты в совокупности покрыты белковой оболочкой, образуя нуклеокапсид. Снаружи вирион ортомиксовирусов покрыт суперкапсидной оболочкой, имеющей шипы, образованные гемагглютинином и нейраминидазой. Между нуклеокапсидом и суперкапсидом располагается матриксный белок М. Нуклеокапсид с М-белком в совокупности составляют сердцевину вириона.
Устойчивость. Ортомиксовирусы слабо устойчивы во внешней среде. Под действием ультрафиолетового света они погибают в течение 5 минут. В 70%-ном этиловом спирте вирусы гибнут через 5 минут, в 3%-ном феноле, 1%-ной настойке йода, 1%-ной сулеме, 1%-ном купоросе – через 3 минуты.
Морфология. Вирионы вируса гриппа являются “одетыми”, сферической формы, полиморфные, размером 80-120 нм, содержат 32 капсомера. Снаружи они имеют липопротеиновую оболочку, которая образует выступы (шипы). Вирионы ортомиксовирусов состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки (суперкапсида), которая имеет выступы, образованные из гемагглютинина и нейраминидазы. Между нуклеокапсидом и суперкапсидом располагается М-белок.
Геном вирионов вируса гриппа образован однонитевой спиральной молекулой минус-РНК. Геном состоит из отдельных фрагментов (у вирусов гриппа А и В – 8 фрагментов, у вируса гриппа С – 7 фрагментов). Каждый фрагмент вирусной РНК покрыт отдельным белком. РНК упакована в комплексе с белками в виде спирали, составляя cor или нуклеокапсид. На поверхности вирионов имеется множество мелких шипов, построенных из гликопротеинов с гемагглютинирующей или нейраминидазной активностью.
Нуклеокапсид имеет спиральный тип симметрии. Сердцевина окружена мембраной, состоящей из белка М, который соединяет рибонуклеопротеин с двойным липидным слоем внешней оболочки (суперкапсидом) и шиповидными отростками гемагглютинина и нейраминидазы.
Суперкапсид образован липидным бислоем, который пронизывают гликопротеиновые шипы (спикулы), определяющие гемагглютинирующую (Н) или нейраминидазную (N) активность. В вирионе обнаружено 7 структурных белков, из которых 3 белка являются наружными и 4 белка - внутренние. К наружным структурным протеинам относятся гемагглютинин (Н), нейраминидаза (N) и белок М. Гемагглютинин и нейраминидаза входят в состав суперкапсида. Они заякорены гидрофобными концами в липидном бислое суперкапсида и структурно оформлены в виде шипов, выступающих на поверхности вириона. Внутри вириона гемагглютинин и нейраминидаза контактируют с М-белком, а через него - с сердцевиной.
Гемагглютинин и нейраминидаза являются гликопротеинами и входят в состав липопротеиновой оболочки вириона (суперкапсида). Гемагглютинин изменчив (у вирусов гриппа А человека и животных выявлено 16 антигенных типов или вариантов гемагглютинина – от Н1 до Н16). Антитела к нему обеспечивают защитный эффект.
Функции гемагглютинина:
- прикрепительная (связывается с сиаловой кислотой рецепторов поверхности эпителиальных клеток);
- участие в слиянии (содержит пептид слияния) оболочки вириона с мембранами клетки и гемагглютинации, агрегируя (склеивая) эритроциты;
- протективные свойства, способствующие развитию иммунитета (вируснейтрализующие антитела).
Нейраминидаза распознает и взаимодействует с рецепторами клетки, содержащими N-ацетилнейраминовую кислоту, то есть приводит к проникновению вируса внутрь клетки, а также, отщепляя нейраминовую кислоту от дочерних вирионов и клеточной мембраны, к выходу вирусов из клеток и распространению вирионов. Нейраминидаза изменчива – у вируса гриппа А человека и животных выявлено 9 вариантов нейраминидазы (от N1 до N9). У вируса гриппа типа С нейраминидаза отсутствует; ее заменяет ацетилэстераза, отрезающая ацетильные группы гликопротеинов. Нейраминидаза образует отдельные шипы, которых меньше, чем количество шипов гемагглютинина. Нейраминидаза отделяет вирионы от сиалированных муцинов, покрывающих слизистую оболочку, способствуя продвижению вируса к поверхности эпителиальных клеток. При завершении репликативного цикла она помогает отделению созревших вирионов от эпителиоцитов.
Протеин М (матриксный белок) выстилает липопротеиновую оболочку изнутри вирусной частицы. Он представлен белками М1 и М2. Матриксный белок М1 и мембранный белок М2 окружают нуклеокапсид и защищают геном. При этом М1-белок взаимодействует с нуклеокапсидом и оболочкой, а М2-белок формирует мембранный канал.
Три внутренних структурных протеина (РВ1, РВ2, РА) формируют нуклеокапсид, а также участвуют в транскрипции и репликации вируса. Так, белки Р1 или РВ1 являются транскриптазой, Р2 или РВ2 – эндонуклеазой, Р3 или РА – репликазой. Четвертый внутренний белок (NР) связан с наружным фрагментом РНК и выполняет регуляторные и структурные функции.
Кроме структурных белков для вируса гриппа характерны неструктурные белки NS1и NS2, существующие только в инфицированной клетке.
Репродукция вируса гриппа состоит из следующих этапов:
1. Адсорбция и проникновение вируса внутрь клетки. Вирус адсорбируется на клетках за счет взаимодействия гемагглютинина с сиаловой кислотой рецепторов клеточных мембран и проникает внутрь.
2. Депротеинизация капсида и его проникновение в ядро клетки. В цитоплазме клетки нуклеокапсид освобождается от суперкапсида и выходит в цитоплазму. Отсюда вместе с М-белком он транспортируется в ядро, где уже через несколько минут после заражения появляются первые РНК-транскрипты.
3. Образование полных и неполных плюс-нитей РНК. В ядре клетки происходит трансформация геномной минус-нити РНК с помощью вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы в неполные и полные плюс-нити. Неполные плюс-нити являются иРНК для синтеза вирусных белков, а полные плюс-нити служат матрицей для синтеза геномных минус-нитей РНК.
4. Трансляция вирусных белков. После выхода молекул мРНК из ядра в цитоплазму клетки происходит трансляция вирусных белков (NP, РВ1, РВ2, РА и М) на полирибосомах. Белки NP, РВ1, РВ2 и РА после синтеза из цитоплазмы возвращаются в ядро, где связываются с вновь синтезированной вирусной РНК, а затем в виде нуклеокапсида возвращаются в цитозоль. Матриксный белок М после синтеза в цитоплазме движется к внутренней поверхности клеточной мембраны, вытесняя из нее в этом участке клеточные белки. Белки N и H синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, подвергаются гликозилированию и транспортируются на внешнюю поверхность клеточной мембраны, встраиваясь напротив белка М и образуя шипы. Белок Н при этом подвергается разрезанию на субъединицы НА1 и НА2.
5. Формирование потомства вирионов. На границе ядерной мембраны белки капсида и РНК потомства формируют нуклеокапсиды, которые мигрируют в цитоплазму для дальнейшего созревания. В модифицированных М-белком участках клеточной мембраны нуклеокапсиды окончательно созревают и выходят из клеток путем почкования.
6. Выход вирионов из клетки происходит почкованием. При этом сформированный нуклеокапсид, проходя через мембрану клетки, окружается белком М и измененной мембраной клетки, содержащей гемагглютинин и нейраминидазу.
Грипп. Слово “грипп” заимствовано из французского языка и в понятии “эпидемический (заразный) насморк” используется в России с начала XIX в. Значительно раньше болезнь называли “инфлюэнцей”. Термин “инфлюэнца” принят во многих странах, но у нас утвердилось понятие “грипп”, отражающее клинико-эпидемиологическую сущность болезни: острое начало, быстрое развитие и распространение среди людей (фр. grippe - хватать, схватывать). Первая из наиболее полно описанных эпидемий гриппа относится к 1510 г. В 1918 г. случилась необычная по масштабам и последствиям пандемия (глобальная эпидемия) гриппа. Как и большинство крупных вспышек, она возникла в Юго-Восточной Азии (Китае), но по случайному стечению обстоятельств зафиксирована в истории как “испанский грипп”, или просто “испанка”. В течение 2-3 лет от испанки погибло более 20 млн. человек. Последующие эпидемии гриппа, хотя и перерастали неоднократно в пандемии, не приносили столько жертв.
Современная история гриппа началась в 1933 г., когда был выделен его возбудитель – вирус гриппа типа А. Это удалось сделать В. Смиту и его коллегам при заражении африканских хорьков ультрафильтратом смыва из зева больного гриппом (им был В. Смит - один из авторов открытия). Заболевание, которое последовало у зараженных животных, очень напоминало грипп человека. В 1940 г. был изолирован вирус гриппа типа В, а в 1947 г. – вирус гриппа типа С.
Экология. Кроме человека в естественных условиях вирусы гриппа инфицируют млекопитающих и птиц. Так, в последние годы зарегистрированы случаи заражения людей штаммами вируса гриппа А, циркулирующими среди птиц. Реальная тревога возникла в 1997 г. в Гонконге, когда 18 человек напрямую заразились от домашних птиц вирусом Н5N1; 6 человек погибло. В 2003 г. высоковирулентные штаммы птиц Н5N1 и Н7N7 спровоцировали фатальные случаи гриппа среди жителей Южной Азии. Вирусы типов В и С поражают людей и в естественных условиях не инфицируют других хозяев.
Патогенез. Вирусы гриппа проникают в респираторный тракт с каплями аэрозоля и частицами пыли. Чем мельче их величина, тем глубже проникает вирус; самые мелкие частицы достигают бронхиол и альвеол. Главным местом размножения вируса служат реснитчатые и бокаловидные клетки слизистой оболочки верхних дыхательных путей, но инфекция может охватить весь респираторный тракт - от носовых ходов до терминальных бронхиол и альвеол. Повреждение зараженных эпителиоцитов приводит к выходу вируса в кровь. Находясь в крови, вирус гриппа не оказывает патологического воздействия из-за отсутствия сывороточных и тканевых протеаз, способных активировать вирусный гемагглютинин.
В зонах выраженного повреждения эпителия могут развиваться осложнения, вызванные присоединением бактериальной инфекции.
Освобождение от вируса начинается после повреждения слизистой оболочки. Продукты распада эпителиоцитов и медиаторы воспаления стимулируют продукцию слизи, а уцелевшие клетки мерцательного эпителия и кашлевые толчки проталкивают ее вверх вместе с основной массой вируса. Этот простой, но надежный механизм в сочетании с ринореей предупреждает распространение инфекции по респираторному тракту, способствуя выздоровлению.
Вирус гриппа А.
Эпидемиология. Источник инфекции - только больной человек. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Инкубационный период очень короткий, возникшая эпидемия распространяется очень быстро и при отсутствии коллективного иммунитета может перерасти в пандемию.
Особенности патогенеза и клиники. Инкубационный период при гриппе короткий - 1-2 суток. Вирус размножается в эпителиальных клетках слизистой оболочки дыхательных путей с преимущественной локализацией в области трахеи, что клинически проявляется в виде сухого мучительного кашля с болями по ходу трахеи. Продукты распада пораженных клеток попадают в кровь, вызывают сильную интоксикацию и повышение температуры тела до 38-39°С. Вирус гриппа оказывает угнетающее действие на кроветворение и иммунную систему. Все это может приводить к вторичным вирусным и бактериальным инфекциям, которые осложняют течение болезни.