Статья: В-клеточное звено в регуляции аутоиммунных заболеваний

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.

В-клеточное звено в регуляции аутоиммунных заболеваний

А.В. Соколов, А.А. Шмидт, Я.А. Ломакин

В-клетки являются одним из центральных элементов гуморального иммунитета. Традиционно считалось, что основная роль В-клеток заключается в продукции антител, однако в дальнейшем было выявлено их непосредственное участие и в клеточном иммунитете. В-лимфоциты участвуют в активации Т-клеток путем презентации антигена, костимуляции и выработке цитокинов; влияют на противомикробные защитные механизмы и воспалительные процессы в тканях организма; также они выступают в роли регуляторных клеток, которые управляют и клеточными, и гуморальными иммунными ответами.

Предположения о существовании В-клеток, способных к подавлению иммунного ответа, высказывались уже в семидесятые годы прошлого столетия. Группа профессора Джеймса Турка обнаружила, что удаление В-клеток из пула спленоцитов морской свинки приводит к невозможности ингибирования реакции гиперчувствительности замедленного типа (delayed-type hypersensitivity, DTH) [1]. Однако охарактеризовать это наблюдение с молекулярной или биохимической точки зрения на тот момент не представлялось возможным, поэтому исследования были приостановлены. И только спустя 20 лет впервые были достоверно описаны регуляторные свойства В-клеток при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите (ЭАЭ) - животной модели рассеянного склероза у человека. Иммунизация генетически модифицированных мышей с делецией В-лимфоцитов (линия B10.PLpMT) пептидом основного белка миелина (ОБМ) приводила к развитию острой и более тяжелой формы ЭАЭ. Патологический процесс протекал неконтролируемо, не наблюдалось спонтанной ремиссии, характерной для мышей линии B10.PL, продуцирующих зрелые В-клетки [2]. За последние 10 лет в изучении иммуносупрессорных В-клеток достигнут большой прогресс. Стало известно, что регуляторные В-клетки (B regulatory cell, Breg) способны влиять на дифференци- ровку Т-клеток, смещая ее в сторону регуляторного фенотипа [3]. С тех пор регуляторная функция В-лимфоцитов была показана и на животных моделях аутоиммунного колита, ревматоидного артрита, аутоиммунного диабета и системной красной волчанки (СКВ) [4-6].

МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ РЕГУЛЯТОРНЫХ В-КЛЕТОК

Впервые само понятие регуляторных В-клеток было сформулировано совсем недавно S. Fillatreau [4] при описании вырабатывающих интерлейкин-10 (ИЛ-10) В-клеток (В10-клеток), способных уменьшать клинические проявления ЭАЭ. Как один из противовоспалительных цитокинов, ИЛ-10 регулирует иммунные реакции и влияет в основном на антигенпрезентирующие клетки, уменьшая экспрессию провоспалительных цитокинов и молекул, участвующих в презентации антигена (ГКГС I, ГКГС II, молекулы адгезии и др.), а также ингибирует пролиферацию и CD4+ Т-лимфоцитов [5]. Последующие эксперименты по удалению популяции В10-лимфоцитов у мышей также выявили корреляцию с уменьшением количества Treg, ассоциированной к тому же с избыточной пролиферацией провоспалительных Т-клеток после индукции аутоиммунного ответа [6]. Продуцируя ИЛ-10, Breg подавляют дифференцировку Т-хелперных клеток типа 1 (T helper 1, Th1) и Т-хелперов 17 (T helper 17, Th17), понижая выработку провоспалительных цитокинов дендритными клетками [7]. Таким образом, выработка ИЛ-10, как наиболее широко изученный В-клеточный регуляторный механизм, часто используется для выявления новых субпопуляций Breg. Тем не менее в последнее время появляется все больше данных и о других механизмах, с помощью которых Breg контролируют развитие иммунного ответа, таких, как выработка TGF-P (трансформирующий фактор роста-Р), ИЛ-35, IgM, IgG4, воздействие на Т-лимфоциты путем прямых межклеточных взаимодействий и т.д. (таблица). При этом часто выявляют регуляцию иммунных процессов с использованием одновременно нескольких механизмов - например, путем продукции как ИЛ-10, так и TGF-P, оба из которых по большому счету ингибируют Т-клеточный ответ [8]. Показано, что активированные липополисахаридом (ЛПС) В-клетки, несмотря на повышенный уровень экспрессии ИЛ-10, способствуют апоптозу CD4+ и инактивации CD8+ эффекторных Т-клеток именно за счет продукции TGF-P [9, 10]. Особое внимание стоит обратить и на ИЛ-35 - еще один охарактеризованный совсем недавно ключевой иммунорегуляторный цитокин, вырабатываемый Breg. У генетически модифицированных мышей, В-клетки которых не экспрессируют субъединицы ИЛ-35, развивалась острая форма ЭАЭ. В случае воспаления, вызванного Salmonella typhimurium, отсутствие экспрессии ИЛ-35 В-клетками приводило к увеличению пролиферации Th1 и повышению количества макрофагов в селезенке [11]. В другом независимом исследовании показано, что стимулированные ИЛ-35 В-клетки вырабатывали ИЛ-35 и могли ингибировать экспериментальный увеит при адоптивном переносе [12]. Доказана важная роль Breg в поддержании баланса и функций естественных киллерных Т-лимфоцитов типа 1 (invariant natural killers, iNKT), необходимых для поддержания толерантности к антигенам организма при аутоиммунных заболеваниях [13].

Как видно из таблицы, упомянутые механизмы действуют в основном на субпопуляции Т-лимфоцитов с провоспалительными свойствами, ингибируя их дифференцировку и развитие, тем не менее наблюдаются и другие эффекты Breg (например, ослабление активации системы комплемента и удаление апоптотических телец), которые в итоге также ведут к снижению силы иммунных реакций[14].

В функционировании Breg принимают участие такие молекулы, как CD40, TLR, В-клеточный рецептор, CD19, CD1d и др. [14]. Мембранный рецептор CD40, активированный соответствующим лигандом (CD40L, присутствующий на мембране эффекторных Т-клеток), способен стимулировать каскадные реакции. Тем самым CD40 вовлечен в развитие В-клеток памяти, переключение классов иммуноглобулинов и формирование герминативных центров. Его участие в функционировании регуляторных В-клеток показано на В-лимфоцитах мыши и человека. Активация В-клеток в присутствии лиганда или активированных Т-клеток инициировала выработку ИЛ-10 и способствовала началу процесса регенерации при ЭАЭ; и наоборот, блокирование рецептора или его элиминация (CD40-/-) делали невозможным синтез ИЛ-10.

Известно, что Толл-подобные рецепторы (TLR) распознают большое разнообразие молекулярных эпитопов и играют важную роль в передаче сигналов во врожденном и адаптивном иммунитете. Стимуляция TLR соответствующими антигенами увеличивает выживаемость мышей в моделях СКВ и ЭАЭ в сравнении с контрольной группой, не получавшей стимулирующий агент; при этом наблюдается также уменьшение пролиферации Т-клеток и выделение ими провоспалительных цитокинов [40]. В in vitro исследованиях на В-клетках селезенки и периферической крови человека стимуляция антигенами TLR индуцировала выработку ИЛ-10, наибольший эффект вызывала стимуляция липополисахаридом и CpG (лиганды TLR4 и TLR9 соответственно) [22]. Изучена также роль BCR, CD19 и других поверхностных маркеров В-клеток в индукции регуляторного фенотипа. Показано, что активация рецепторов приводит к выработке ИЛ-10, а также к снижению силы клинических проявлений исследуемых заболеваний на животных моделях. Отсутствие же этих молекул заметно нарушает способность В-клеток регулировать иммунные реакции [14]. Повышенный уровень экспрессии В- и Т-лимфоцитарного аттенюатора (BTLA) или лиганда рецептора программиру-Механизмы функционирования В-регуляторных клеток

- ФНО -а, фактор некроза опухолей а;

- GITRL (glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-related ligand) - лиганд глюкокортикоид-индуциро- ванного рецептора фактора некроза опухолей;

- BTLA, В- и Т-лимфоцитарный аттенюатор;

- HVEM (herpes virus entry mediator) - медиатор входа вируса герпеса;

- PD-L1 (Programmed death-1-ligand) - лиганд программируемой гибели клеток-1.

емой смерти (PD-L1) на определенных популяциях В-регуляторных клеток может приводить к уменьшению воспалительного ответа путем ингибирования эффекторных Т- и В-клеток через взаимодействие с HVEM или PD-рецептором соответственно [23, 35, 41]. Приведенные примеры показывают, насколько улучшилось понимание множественных ролей В-регуляторных клеток при условии, что Breg способны взаимодействовать со многими клетками иммунной системы для обеспечения подавления иммунного ответа (рис. 1). Нарушение функций В-регуляторных клеток и их количества чаще всего связано с аутоиммунными заболеваниями.

Становится понятным, что функционирование данной субпопуляции лимфоцитов должно строго контролироваться организмом, начиная с восприятия ими провоспалительных сигналов в своем микроокружении и заканчивая жестким контролем их дифференцировки и развития. Тем не менее, до сих пор неизвестно, всегда ли субпопуляция Breg присутствует в организме или ее развитие индуцируется сигналами извне. Хотя очевидно, что В-лимфоциты выполняют множество функций и в здоровой иммунной системе, и при заболеваниях, они играют как патологическую, так и защитную роль в аутоиммунных процессах, инфекции и аллергии [42].

Рис. 1. Механизмы функционирования В-регуляторных клеток, их влияние на клетки иммунной системы.

Регуляторные В-клетки продуцируют противовоспалительные цитокины, индуцирующие образование регуляторных Т-клеток и поддерживающие функционирование инвариантных естественных киллерных Т-лимфоцитов (iNKT) - обозначено черными стрелками. Продуцируемые Breg интерлейкины (ИЛ) ингибируют дифференцировку Т-фолликулярных хелперов, T-хелперов 1 и 17, ингибируют цитотоксическую активность Т-лимфоцитов (CD8+), ингибируют выработку провоспалительных цитокинов моноцитами и дендритными клетками (красные стрелки). Также регуляторные В-клетки уменьшают воспаление путем прямого межклеточного контакта, через экспрессию В- и Т- лимфоцитарного аттенюатора (BTLA), лигандов рецептора программируемой смерти (PD-L1), выработкой IgM, IgG4 и др.

ФЕНОТИП И ПРОИСХОЖДЕНИЕ В-РЕГУЛЯТОРНЫХ КЛЕТОК

Другой важный вопрос при изучении В-регулятор- ных клеток - определение их фенотипа. На сегодняшний день описано множество различающихся субпопуляций Breg, сходных фенотипически и функционально. Обусловлены ли наблюдаемые между этими субпопуляциями отличия влиянием иммунологического окружения или действительно изначально существуют линии В-регуляторных клеток различного происхождения до сих пор не ясно. У мышей популяции В-регуляторных клеток составляют до 5% от общего пула В-клеток в селезенке и лимфатических узлах, при этом при развитии воспалительных ответов (например, при ЭАЭ [43], индуцированном коллагеном артрите [21] или гельминтозе [44]) их количество значительно возрастает. У мышей выделяют три основных субпопуляции В-регуляторных клеток: T2-MZP (transitional 2 marginal-zone precursor) CD19+CD21highCD23highIgMhigh [31], CD19+CD5+CD1dhlgh [45], Tim-1+ В-клетки [46]. У человека В10-клетки составляют менее 1-2% от общего числа В-клеток крови. Среди Breg человека можно выделить CD19+CD24hiCD38hiCD1dhi и CD19+CD24hiCD27+ [22]. Как связано между собой развитие и дифференцировка данных субпопуляций не установлено. Хотя идентификация выработки ИЛ-10 была хорошим подходом к определению супрессорных В-клеток, многие поверхностные молекулы-маркеры, необходимые для более точной характеристики субпопуляции, могут по-разному экспрессироваться при активации иммунного ответа, что затрудняет изучение Breg в различных экспериментальных условиях, часто ведущих к изменению фенотипа подтипов Breg. Решением данной проблемы может стать идентификация Breg-специфичного транскрипционного фактора, с помощью которого можно ответить на вопрос, принадлежат ли данные клетки к одной линии развития. На сегодня можно предположить две модели развития Breg. Согласно одной из них, регуляторные В-клетки, подобно Treg, представляют собой обособленную линию В-клеток со специфичным набором факторов контроля экспрессии генов, ответственных за их способность к подавлению иммунных реакций. Вторая теория заключается в том, что в ответ на определенные стимулы В-лимфоциты подвергаются фенотипическим перестройкам для подавления местного воспаления. Несмотря на исследования, проведенные на мышах и человеке, обнаружить специфичный транскрипционный фактор пока не удалось. Невозможность идентификации подобного рода маркеров, а также гетерогенность фенотипов Breg указывают на то, что супрессорные В-клетки не являются отдельной линией развития, т.е. любая В-клетка потенциально может дифференцироваться в регуляторную под воздействием внешних факторов [8]. Показано даже, что в дополнение к ранее описанным субпопуляциям Breg, плазмобласты могут также подавлять воспалительные реакции. У мышей, лишенных плаз- мобластов путем генетического удаления транскрипционных факторов Irf4 и Prdml (Blimpl), необходимых для дифференцировки плазматических клеток, развивалась острая форма ЭАЭ [7]. Это не первый случай, когда В-клетки, вырабатывающие антитела, выполняют также регуляторную функцию: CD138+ плазматические клетки, продуцирующие ИЛ-10 и ИЛ-35, подавляли провоспалительные реакции при ЭАЭ и инфекции, вызванной Salmonella enterica. Более того, ранее были описаны В10-клетки в селезенке, которые подвергались дифференцировке в продуцирующие антитела плазмобласты после стимуляции как in vivo, так и in vitro [47]. Были высказаны идеи о наличии связи между CD19+CD24hlCD38hl В-клетками, выполняющими регуляторные функции и секретирующими ИЛ-10 плазмобластами у человека. Такое предположение наводит на мысль о сходном векторе дифференцировки - развитии в плазматические клетки - Breg в организме мышей и человека. Идея о том, что вырабатывающие антитела клетки являются также регуляторами иммунных реакций, плохо сочетается с современным представлением о том, что плазматические клетки вызывают воспалительный ответ, продуцируя антитела, которые часто бывают патогенными в контексте аутоиммунных заболеваний или аллергии. Поэтому возможно, что определенная субпопуляция плазмо- бластов вырабатывает антитела и тем самым поддерживает возможность регуляции воспалительных реакций. Такое предположение подтверждается данными о том, что дефицит Вс16 - транскрипционного фактора, необходимого для пролиферации В-клеток в герминальных центрах, не влиял на развитие регуляторных плазмобластов [7].

Согласно недавним исследованиям, незрелые В-клетки, зрелые В-клетки и плазмобласты способны к дифференцировке в ИЛ-10-продуцирующие Breg в организме мышей и человека. Это подтверждает предположение о том, что для дифференци- ровки регуляторных В-клеток необходим не специфичный транскрипционный фактор, а скорее среда, в которой находится В-лимфоцит. Таким образом, поиск стимулов, необходимых для приобретения В-клеткой регуляторных функций, становится важным для оценки происхождения Breg. Тем не менее, недавно показано, что и провоспалительные цитокины могут вызывать дифференцировку регуляторных В-клеток, вырабатывающих ИЛ-10 [8].

РОЛЬ РЕГУЛЯТОРНЫХ В-КЛЕТОК В РАЗВИТИИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ОТВЕТА

Существуют убедительные доказательства того, что количество Breg и их способность к подавлению иммунного ответа возрастают при воспалении. Известно, что они присутствуют у «наивных» мышей, но число их увеличивается при развитии некоторых аутоиммунных заболеваний [31, 48]. Более того, установлено, что Breg участвуют в подавлении воспаления при аутоиммунных патологиях, например, в отсутствие Breg в животной модели РС развиваются более тяжелые и острые формы ЭАЭ [4, 6]. Недавно было показано, что количество регуляторных В-клеток увеличивается в ответ на выделение провоспалительных цитокинов ИЛ-1Р и ИЛ-6 после индукции артрита [49]. Выделение этих цитокинов у мышей с артритом контролируется сообществом бактерий в кишечнике. Ранее роль микробиоты уже была показана при дифференцировке проартритогенных ТЫ7 [50]. У выросших в нестерильных условиях мышей, В-клетки которых не экспрессируют ИЛ-Ш1 или ИЛ-6R, развивается острая форма артрита [49]. Таким образом, можно предположить, что пролиферация Breg повышается в ответ на ИЛ-1Р и ИЛ-6 для предотвращения неконтролируемой амплификации провоспалительных лимфоцитов, таких, как ТЫ7. Другие воспалительные цитокины, необходимые для дифференциации фенотипа ТЫ7 - ИЛ-21 и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (granulocyte macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) вместе с ИЛ-15, - также играют важную роль в развитии Breg [51, 52]. Идентифицированы различные источники цитокинов, которые могут вызвать повышение выработки ИЛ-10 В-клетками. Миелоидные клетки лимфатических сосудов и селезенки, продуцирующие ИЛ-6 и ИЛ-lЯ, ответственны за увеличение количества Breg при артрите, в то время как CD4+ Т-клетки селезенки, вырабатывающие ИЛ-21, активируют Breg при экспериментальном артрите [49, 52]. С другой стороны, введение мышам противовоспалительного цитокина ИЛ-35 увеличивало популяцию В-клеток, экспрессирующих ИЛ-10 и ИЛ-35, и тем самым подавляло развитие увеита [53]. Однако стоит учитывать, что ИЛ-35 не экспрессируется постоянно, а индуцируется в ответ на воспаление [54].

Хотя перечисленные цитокины явно играют важную роль в пролиферации Breg, нельзя забывать о том, что при развитии иммунного ответа В-клеточные рецепторы (B-cell receptor, BCR) необходимы также для индукции Breg. У мышей линии MD4, BCR которых специфичен к куриному лизоци- мому (HEL - hen egg lysozyme), нарушена активация Breg при развитии ЭАЭ. Было показано, что химерные животные с В-клетками MD4 или В-клетками, неспособными к продукции ИЛ-10, развивают более тяжелые формы ЭАЭ и не способны к восстановлению [4]. Также В-клетки MD4 выделяют меньше ИЛ-10, а число самих В10-клеток меньше, чем у мышей дикого типа [45, 55]. О важности правильного узнавания BCR в Breg свидетельствуют результаты, полученные с использованием мышей со специфичной делецией молекул стромального взаимодействия 1 (STIM-1, stromal interaction molecule 1) и STIM-2 в В-клетках. Эти молекулы необходимы для регуляции поступления кальция в цитозоль В-клеток после взаимодействия BCR с антигеном. У мышей, В-лимфоциты которых лишены STIM-1 и STIM-2, наблюдается снижение продукции ИЛ-10 после стимуляции аутоантигеном МОГ (миелин-олигоден- дроглиоцитарный гликопротеин) [56]. Эти данные показывают, что антигенспецифичное узнавание В-клеточного рецептора важно для функционирования и пролиферации Breg. В ответ на распознавание В-клеточного рецептора при развитии иммунного ответа В-клетки могут дифференцироваться в регуляторные или вырабатывающие антитела клетки.

Значимость воспалительного ответа в диффе- ренцировке Breg поднимает вопрос о месте их созревания. На сегодняшний день в большинстве работ изучали популяции В-клеток в селезенке. Однако Breg выявлены также в лимфатических сосудах, близких к месту воспаления, при колите и ЭАЭ [7, 48]. Более того, регуляторные В-клетки могут развиваться и приобретать способность к подавлению иммунного ответа вне селезенки, а именно, в лимфатических сосудах (при этом удаление селезенки не влияет на их появление)

. Все эти данные поддерживают теорию, согласно которой Breg индуцируются под влиянием воспалительного окружения, что противоречит ранее опубликованным результатам, характеризующим селезенку как основное место развития регуляторных В-клеток.

В-КЛЕТОЧНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ В РАЗВИТИИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЙ

Рассеянный склероз (РС)

Популяция регуляторных В-клеток также участвует в патогенезе РС, занимающего особое место в списке аутоиммунных патологий и являющегося одним из наиболее социально и экономически значимых неврологических заболеваний современности. РС возникает в основном у лиц среднего возраста, за 10-15 лет приводит к практически полной потере трудоспособности, а при недостаточно эффективном и своевременном лечении и к летальному исходу. Длительное время ведущая роль в развитии РС отводилась Т-клеточному звену иммунитета. Однако в настоящее время существует множество данных, указывающих на важную роль В-клеток в патогенезе РС [57, 58]. У пациентов даже обнаружены каталитические антитела, гидролизующие основной белок миелина - один из знаковых аутоантигенов РС [59, 60]. И хотя этиология РС до сих пор не до конца ясна, в качестве факторов, связанных с его возникновением, наряду с генетической предрасположенностью, гормональным статусом и климатическими условиями, особое внимание уделяется бактериальным и вирусным инфекциям. Считается, что молекулярная мимикрия и кросс-реактивность могут лежать в основе механизмов вирусной индукции заболевания. Еще в 2003 г. было показано кросс-реактивное узнавание моноклональным Т-клеточным рецептором ядерного антигена вируса Эпштейна-Барр (EBNA) и аутоантигенного пептида основного белка миелина (ОБМ) [61]. Позже обнаружили и подтвердили наличие кросс-реактивности и у аутоантител к белку LMP1 вируса Эпштейна-Барр и ОБМ [62, 63]. При ЭАЭ Breg могут ингибировать аутоиммунные Т-клеточные ответы, замедляя дифференцировку провоспалительных Т-хелперов 1, специфичных к аутоантигенам ЦНС [57]. Отсутствие же Breg приводит к обострению реакций иммунной системы. Как уже упоминалось ранее, у мышей с ЭАЭ, лишенных В10-клеток, развивалась острая форма болезни без ремиссии [4]. Регуляторные функции В-клеток, вырабатывающих ИЛ-10, подтверждены результатами исследования, в котором адоптивный перенос В-клеток дикого типа уменьшал тяжесть проявлений ЭАЭ, в отличие от переноса В-лимфоцитов ИЛ-10-/- от мышей линии |ЛМТ. В данном эксперименте В-клетки мышей первой группы вырабатывали ИЛ-10. Недавно охарактеризовали связь между В- и Т-регуляторными клетками в развитии патологии при ЭАЭ [43]. Адоптивно перенесенные В10-клетки действительно прямо влияли на патогенез ЭАЭ, как и в работе М. Янга [64] при этом их количество увеличивалось в селезенке, но не в ЦНС, что соответствует представлениям о наличии у них регуляторных функций. Более того, перенос активированных антигеном В10-клеток в мышей дикого типа сильно замедлял инициацию ЭАЭ, однако В10- лимфоциты не могли ингибировать дальнейшую прогрессию ЭАЭ. В то же время количество регуляторных Т-клеток в ЦНС заметно увеличивалось при развитии заболевания, и этот процесс влиял на течение ЭАЭ на поздних стадиях. На основании этих данных можно предположить, что Breg играют ведущую роль на ранних стадиях болезни, в то время как Treg выполняют регуляторные функции при дальнейшем развитии заболевания.