Статья: Новый метод детекции родаминовой метки и возможности его применения в зоологических исследованиях

Изменений в поведении меченых зверьков отмечено не было. В ходе экспериментов зафиксировано три смертельных случая. Два самца (№ 4 и № 11, табл. 1) умерли на 589-й и 111-й день эксперимента соответственно (вероятно, от старости, так как каких-либо патологий при вскрытии не обнаружено). Умер один из детенышей в эксперименте по передаче маркера через молоко матери (детеныш 1 самки 13, табл. 1). Мы считаем, что этот зверек также погиб по естественным причинам, поскольку при рождении он был самым маленьким и слабым в помете.

Тестирование нового способа детекции метки

Метка была обнаружена in vivo (без использования микроскопа) и post mortem (с применением микроскопа) у всех особей, съевших корм с родамином B (n=21), а также у детенышей, получивших маркер с молоком (n=7).

Мы выяснили, что эффективность распознавания метки зависит от свойств используемого фильтра. Без оранжевого фильтра метка не видна. Со слабым фильтром она выглядит оранжевой или не видна из-за “засветки” интенсивным излучением лазера. Наилучшие результаты дают фильтры, через которые родаминовая метка выглядит светложелтой или золотистой (рис. 2, см. дополнительный материал). Необходимого эффекта можно добиться увеличением числа слоев материала, используемого в качестве фильтра. Установлено, что помимо стекла ОС-14 в качестве фильтра эмиссии можно применять любое оранжевое стекло или прозрачный оранжевый пластик. Например, эффект слабого фильтра дают очки EURONDA, а эффект сильного - стек из двух слоев тех же очков или стекло ОС-14.

Рис. 2 Вид родаминовой метки на теле лабораторной мыши: A - при комнатном освещении (метка не видна); B - в свете зеленого лазера без фильтра на объективе микроскопа (метка не видна); C - в свете зеленого лазера со слабым фильтром (оранжевые участки - родаминовая метка); D - с сильным фильтром (желтые участки - родаминовая метка)

Fig. 2 View of rhodamine mark on the body of the laboratory mouse: A - under ambient light (label not visible); B - under light of a green laser without a filter on the microscope lens (the label is not visible); C - under light of a green laser with a weak filter (orange areas - a rhodamine label); D - with a strong filter (yellow areas - a rhodamine label)

Рис. 3 Флуоресцирующая родаминовая метка (желтые участки) на шкуре, вибриссах и когтях живой лабораторной мыши, содержавшейся на корме с родамином в течение недели (№ 6; 7 дней после окончания мечения)

Fig. 3 A fluorescent rhodamine label (yellow patches) on the fur, vibrissae and claws of a live laboratory mouse fed with rhodamine B bait for a week (No. 6; 7 days after the end of the marking)

Обнаружено, что флуоресценция рода- миновой метки видна не только в полной темноте, но и при сумеречном освещении.

детекция родаминовый метка животное

Локализация и динамика метки

У всех лабораторных животных рода- миновая метка была обнаружена на шкуре, вибриссах и когтях (рис. 3). В первую неделю яркая флуоресценция наблюдалась в местах непосредственного контакта с красителем (в области рта и на передних лапах), на частях тела, которые активно чистятся мышами (уши, хвост), а также в области уретры из-за выхода маркера с мочой. В это же время хорошо заметно свечение в желудочно-кишечном тракте и фекалиях. Через три дня после мечения системная метка четко видна на вибриссах мышей. Обнаружено, что скорость продвижения метки не одинакова для разных вибрисс одной особи. В некоторых вибриссах метка отсутствовала.

При осмотре шкуры живых зверьков нам обычно не удавалось точно определить момент появления системной метки, так как первая фаза процесса скрыта от наблюдения верхними слоями волос и завуалирована сохраняющимися следами непосредственного контакта с маркером, а также с мочой и фекалиями в первые дни после поедания приманки. Поверхностные следы родамина B исчезают и заменяются системной меткой постепенно, что заметно по смене локализации флуоресцирующих участков. Мы обнаружили, что площадь, на которой проявлялась метка, всегда составляла значительно меньше 50 % поверхности тела, а расположение флуоресцирующих участков было индивидуальным для каждой особи. С течением времени число и площадь светящихся участков шерсти сокращается и к концу срока наблюдения сводится к отдельным волоскам (рис. 4). Результаты опытов по сроку сохранения метки представлены в табл. 1. Выяснилось, что после того, как метку становится невозможным рассмотреть невооруженным глазом (без увеличения), ее еще можно уверенно обнаружить с помощью микроскопа спустя несколько дней после этого (рис. 4).

Рис. 4 Участок шкуры лабораторной мыши на вентральной стороне тела с родаминовой меткой в виде отдельных светящихся волосков (№ 12; 366 дней после мечения)

Fig. 4 A part of the laboratory mouse' skin on the ventral side of the body with the rhodamine label as separate luminous hairs (No. 12; 366 days after marking)

Максимальное значение показателя - 423 дня. Эта же особь (лаб. № 4) спустя еще 149 дней после исчезновения первой метки была успешно помечена повторно.

В опытах по опосредованному мечению через материнское молоко после отрастания шерсти у детенышей выяснилось, что все они имеют метку в волосах по всей поверхности тела (n=7). По мере роста молодых особей флуоресцирующие участки фрагментировались и метка исчезала заметно быстрее, чем это происходит у взрослых животных. Срок удержания метки детенышами составляет не менее четырех месяцев (опыт был прекращен).

Обсуждение

Разработка нового способа детекции родамина B проводилась нами, главным образом, для применения в массовом неизбирательном самомечении животных, поэтому лабораторным мышам маркер давали с пищей, в виде готовой приманки, которая потенциально может использоваться и в полевых исследованиях. В ходе опытов мы не обнаружили у животных явных признаков отвращения к нашей приманке. За два года исследований мы наблюдали только три случая самопроизвольной смерти подопытных мышей, и у нас нет оснований считать, что они погибли из-за биомаркера. Особи, получавшие пищу с более высокой концентрацией красителя (1000 и 1500 мг/кг однократно), как и те, которые содержались только на корме с родамином B в течение недели, не погибли. Зверек, помеченный дважды (лаб. № 4), благополучно достиг возраста более 589 дней (дата рождения не известна). Следует отметить, что к настоящему времени безопасность родамина B для животных уже достаточно хорошо обоснована и ее проверка не являлась целью нашего исследования. Более подробную информацию по данному вопросу можно найти в других работах (Fisher, 1999 и ссылки там).

Мы обнаружили, что эффективность выявления родаминовой метки очень зависит от применяемого фильтра. Наиболее яркое и контрастное изображение удается получить с фильтром, через который метка выглядит светло-желтой или золотистой. С более слабыми фильтрами метка имеет оранжевый цвет и видна намного хуже (рис. 2). Примечательно, что во всех известных нам работах, где родамин B выявляли с помощью люминесцентных микроскопов, авторы описывают метку именно как оранжевую, что вызывает вопросы относительно правильности подбора фильтров в некоторых приборах.

В ходе исследования установлено, что новый способ детекции родамина B значительно надежнее общепринятого. Распространенный до настоящего времени протокол предполагает взятие нескольких проб (волосков) из шкуры и/или вибрисс животного с последующим просмотром под люминесцентным микроскопом. Процедура пробоотбора является “ахиллесовой пятой” общепринятого метода детекции данного маркера. Известно, что родамин B в качестве системной метки включается только в растущие структуры, а рост волос идет неравномерно на различных участках тела (Fisher, 1999; Spurr, 2002; Weerakoon et al., 2013). Фактически распределение флуоресценции по телу меченого зверька отмечает участки шкуры, где происходил рост волос в тот период, когда был съеден корм с маркером. В ходе апробации нового способа детекции мы обнаружили, что у всех животных, съевших приманку, площадь флуоресцирующих частей шкуры составляет явно менее 50 %. Это верно даже в отношении двух мышей, которые получали родамин B в течение недели (рис. 3). Поэтому при “слепом” взятии проб, как это делается в случае использования люминесцентной микроскопии, велика вероятность попасть на участок без метки. Вибриссы считаются более надежным индикатором, чем шерсть (Fisher, 1999; Weerakoon et al., 2013), однако нами были установлены случаи, когда метка проявлялась на шкуре зверька, но отсутствовала в вибриссах, что также подтверждается литературными данными (Purdey et al., 2003). Кроме того, длительность сохранения маркера в вибриссах не превышает двух месяцев (Jacob et al., 2002; Fernandez, Rocke, 2011). Таким образом, при использовании общепринятой процедуры детекции метки существует вероятность получения ложноотрицательных результатов, что ранее отмечалось исследователями (Jacob et al., 2002; Weerakoon et al., 2013), тогда как предлагаемый вариант метода позволяет просматривать всю поверхность тела животного, включая шерсть, вибриссы и когти (рис. 3). Поэтому в наших опытах метка была обнаружена у всех меченых животных.

Важнейшим преимуществом неизбирательного мечения является возможность быстро и с минимальными трудозатратами пометить множество животных на определенной территории для получения как можно большего объема данных. Учитывая массовость получаемого материала, такие параметры метода, как степень сложности и стоимость, приобретают повышенное значение. Разработанный нами способ детекции родамина B делает методику мечения этим маркером значительно проще и дешевле. Очевидно, что стоимость комплекта оборудования для использования нового метода на несколько порядков меньше, чем у люминесцентных микроскопов. Кроме того, разработанный нами способ детекции метки в отличие от общепринятого не предполагает использования каких-либо расходных материалов. Процедура выявления родамина в теле животных по новой схеме не требует много времени. Полный осмотр одной мыши, например, занимает 1-2 мин (без учета фотографирования). Кроме того, детекцию метки новым способом можно проводить в полевых условиях, что часто бывает важным для зоологов и по понятным причинам затруднено в случае со специализированным микроскопом. Полевое применение облегчается еще и тем, что метка хорошо видна не только в полной темноте, но и при сумеречном освещении.

Одним из существенных преимуществ мечения родамином считается возможность выявлять метку in vivo, что может иметь значение как при изучении редких видов, так и по общим соображениям гуманизма. В таких случаях предлагаемый метод делает процедуру детекции метки еще менее инвазивной, поскольку позволяет осматривать все животное целиком без выдергивания волосков или вибрисс. Обобщающее сравнение основных параметров двух методов детекции родамина B дано в табл. 2.

Возможность наблюдать эволюцию метки на живых животных в ходе апробации метода позволила нам установить новые максимальные сроки удержания маркера для млекопитающих вообще и лабораторных мышей в частности. Наибольшая ранее известная продолжительность сохранения родаминовой метки млекопитающими достигала 225 дней (Fichet-Calvet, 1999), а для лабораторных мышей - 84 (Jacob et al., 2002), что значительно меньше установленного нами (423). В наших опытах минимальный срок сохранения метки составлял 165 дней (табл. 1), что позволяет использовать метод, например, для изучения пространственной структуры популяций мышевидных грызунов в зимний период (мечение осенью, отлов весной). При использовании флуоресцентной микроскопии решение вопроса с установлением продолжительности сохранения метки было бы гораздо более затратным и трудоемким, поскольку, как выяснилось в опытах на горностае (Spurr, 2002), для надежной детекции маркера у одного животного нужно выдернуть 9 вибрисс, после чего продолжение опыта на той же особи становится проблематичным. В шерсти родамин B остается дольше, но обнаруживается ранее принятым методом менее надежно. При этом остается проблема с повторным взятием проб у одной и той же особи. Данное ограничение затрудняет совместное применение родами- нового метода и индивидуального мечения с многократными повторными отловами, если используется общепринятый способ детекции метки с выдергиванием волосков.

Таблица 2

Сравнение методов детекции родаминовой метки

Table 2 Comparison of methods for rhodamine mark detection

Важным фактом кинетики родамина B является его способность передаваться детенышам с молоком матери. Такое предположение было высказано ранее на основании косвенных признаков (Fichet-Calvet, 1999) и доказано в наших опытах на лабораторных мышах. Возможность мечения мелких млекопитающих еще до их выхода из гнезда дает более широкие возможности, например, для изучения процесса первичного расселения зверьков.

Одним из возможных применений разработанного нами способа детекции рода- миновой метки может быть изучение закономерностей роста волос у животных (скорость роста и частота смены фаз роста/ покоя на различных участках тела, особенности процесса линьки у различных видов, соотношение общих закономерностей и индивидуальных особенностей роста волос и т.п.).

Заключение

Итогом работы стала разработка нового способа детекции родаминовой метки в теле животных, который обладает рядом существенных преимуществ по сравнению с общепринятым методом: предельная простота, дешевизна, более высокая вероятность обнаружения метки.