Статья: Новый метод детекции родаминовой метки и возможности его применения в зоологических исследованиях

Новый метод детекции родаминовой метки и возможности его применения в зоологических исследованиях

О.В. Толкачев, Е.Н. Беспамятных

Annotation

The New Method of Rhodamine Mark Detection and Its Application Possibilities in Zoological Studies Oleg V. Tolkachev and Elisey N. Bespamyatnykh

Rhodamine B is a perspective biomarker for unselective animal marking. Despite several successful attempts in practical use, the method is still under development. The critical problem is mark detection. We offer the new way of rhodamine mark detection which is simple, inexpensive and effective. White mouse were used as the model object. Instead of random hair sampling for fluorescent microscopy we suggest an inspection ofanimal's whole body surface. For this aim it is possible to employ a green laser (usual laser pointer) as an illuminator and an orange glass or plastic as a filter in front of observer's eyes. When testing the method it is revealed that in adult animalsfluorescing areas soon after marking are usually less than half of the body surface, and being reduced over time. The maximum time interval in which the mark in the pelage was detectable during the examination of living mice ranged from 166 to 423 days. It was revealed that in suckling mice the mark can be formed by milk of females which received a dose of rhodamine B. In these cases the fluorescence manifests itself in whole or most part of the body surface. The mark remains in the fur of mouse cubs at least four months.

Keywords: marking, biomarker, rhodamine B.

Аннотация

Родамин B является перспективным маркером для массового неизбирательного мечения животных. Несмотря на успешные эксперименты по его практическому применению, метод все еще находится в стадии разработки. Основная проблема заключается в процессе выявления маркера в теле животных. В данной работе представлен новый способ детекции родамина B, отличающийся простотой, дешевизной и высокой эффективностью. В качестве объекта использовали лабораторных мышей. Вместо общепринятой процедуры взятия случайных проб из шкуры или вибрисс зверьков с последующим изучением с помощью специализированного микроскопа предлагается осматривать всю поверхность тела животного. Для этого можно использовать зеленый лазер (лазерную указку) в качестве осветителя и оранжевое стекло или прозрачный оранжевый пластик в качестве фильтра перед глазом наблюдателя. При апробации метода установлено, что у взрослых зверьков флуоресцирующие участки вскоре после мечения занимают, как правило, меньше половины поверхности тела, сокращаясь со временем. Максимальные сроки, в которые удавалось обнаруживать метку на шкуре при осмотре живых мышей, составляли от 166 до 423 дней. Обнаружено, что у детенышей лабораторных мышей метка может формироваться за счет молока матерей, получивших дозу родамина B, при этом флуоресценция проявляется на всей или большей части поверхности тела. Метка сохраняется в шкуре детенышей не менее четырех месяцев.

Ключевые слова: мечение, биомаркер, родамин B.

Введение

Массовое неизбирательное самомечение животных является сравнительно редким, но хорошо зарекомендовавшим себя подходом. В фундаментальных исследованиях он используется в изучении миграционных процессов (Lavoie et al., 1971; Большаков, Баженов, 1988; Рыльников, 2007; Григоркина, Оленев, 2013; Tolkachev, 2016 a, b). В прикладной сфере применяется для оценки полноты потребления дикими видами приманки с вакциной или ядом (Lindsey et al., 1971; Slate et al., 2009; Tripp et al., 2014). В самых общих чертах подход подразумевает экспонирование приманки с веществом-биомаркером, после потребления которого особи целевого вида (одного или нескольких) получают метку, позволяющую отличать их от прочих. В качестве маркеров, формирующих системную (включенную в какие-либо ткани тела) метку, могут использоваться различные вещества: антибиотики тетрациклинового ряда (Crier, 1970; Клевезаль, Мина, 1980), иофеноксовая кислота (Massei et al., 2009), сульфадиметоксин (Matter et al., 1998), радионуклиды (Большаков, Баженов, 1988) и некоторые другие вещества (Карасева и др., 2008). Поиск новых маркеров продолжается как потому, что существующие методы имеют недостатки, так и потому, что для исследований миграционной активности животных целесообразно располагать несколькими типами меток.

Одним из многообещающих агентов для массового мечения животных является нетоксичный краситель родамин В. Системная метка в этом случае формируется за счет связывания маркера со структурами тела животного, содержащими кератин (Fisher, 1999). К настоящему времени принципиальная пригодность данного вещества для мечения и его безопасность показаны на лабораторных и диких видах животных: дикая кошка (Fisher et al., 1999), нутрия (Fichet-Calvet, 1999), горностай (Purdey et al., 2003), луговая собачка (Fernandez, Rocke, 2011), домовая мышь (Jacob et al., 2002), лесная мышь и рыжая полевка (Papillon et al., 2002), землеройки-белозубки (Mohr et al., 2007) и др. Однако метод разработан пока не полностью и почти не применяется на практике. Основная проблема - процедура выявления родамина в теле животных.

Общепринятый протокол детекции родаминовой метки описан в статье Фишер с коллегами (Fisher et al., 1999). В соответствии с этой методикой до настоящего времени выявление метки во всех случаях проводилось в волосяном покрове с помощью флуоресцент- ной/люминесцентной микроскопии (Fisher, 1999; Papillon et al., 2002; Southey et al., 2002; Spurr, 2002; Jacob et al., 2003; Johnston et al., 2007; Mohr et al., 2007; Weerakoon et al., 2013). Детекция родаминовой метки по общепринятой методике предусматривает довольно длительную, трудоемкую и дорогую процедуру подготовки образцов. В частности, используются предметные и покровные стекла, иммерсионное масло, изопропиловый спирт и специальный клей для подготовки препаратов к просмотру. Один препарат обычно включает несколько волосков животного. Вся процедура вместе с сушкой занимает не менее недели. Анализ всего волосяного покрова особи не практикуется из-за высокой трудоемкости и большого расхода материалов. Поэтому среди исследователей существуют разногласия по поводу процедуры пробоотбора, что вызывает вопросы относительно эффективности родаминового метода мечения в целом (Jacob et al., 2002; Spurr, 2002; Weerakoon et al., 2013; Tripp et al., 2014).

Цель данной работы заключалась в усовершенствовании процедуры детекции родаминовой метки.

Материалы и методы

Разработка и тестирование нового метода детекции родаминовой метки были организованы с прицелом на его дальнейшее применение в полевых исследованиях на мелких млекопитающих. Эксперименты проводили в 2015-2017 гг. Маркером служил родамин В или Ы-[6-(Диэтиламино)-9-(2-карбоксифенил)- ЗН-ксантен-3 -илиден]диэтиламмония хлорид, представляющий собой кристаллы зеленого цвета или порошок красновато-фиолетового цвета (Государственная фармакопея РФ, 2015). Торговое название “Родамин В (С) (чда)”.

В качестве модельного объекта использовали белых лабораторных беспородных мышей обоих полов, которым скармливали единовременно по 2-3 г приманки с родамином B. Кормовую основу приманки готовили на основе овсяных хлопьев. Необходимое количество порошка родамина B насыпали в сухие хлопья и тщательно перемешивали после заливки кипятком. Концентрация маркера в основной части опытов составляла 800 мг на 1 кг сухих хлопьев (0,08 %). Доза красителя в приманке подобрана в соответствии с существующими рекомендациями (Fisher, 1995) и в перерасчете на массу тела составляла ~80-120 мг/кг при LD₅₀ = 890 мг/кг (Fisher, 1999). В предварительных экспериментах использовали и более высокие концентрации родамина B (1000 и 1500 мг/кг корма; n=3). Полученную массу распределяли ровным слоем по металлическому поддону, нарезали шпателем на куски размером ~2х2x1,5 см и сушили не менее 8 ч при 80 °С. Высушенные кусочки приманки опрыскивали нерафинированным подсолнечным маслом с помощью бытового пульверизатора. Спустя сутки после выдачи приманки с маркером зверьков отсаживали в чистые клетки и далее давали только обычный лабораторный корм. В двух случаях мыши содержались на пище с родамином в течение недели (№ 6 и № 19, табл. 1). Еще одна особь (№ 4) получила корм с маркером дважды, с интервалом в 572 дня (оба раза приманка экспонировалась сутки). Для проверки возможности передачи родамина B детенышам во время выкармливания был поставлен отдельный эксперимент. Две самки, содержавшиеся в разных клетках, получили родамин B (800 мг/кг корма), когда их детеныши стали покрываться мехом. Спустя сутки обе самки были отсажены вместе с потомством (в одном помете было три, а в другом - четыре детеныша) в чистые клетки и переведены на обычный корм. Всего в опытах было задействовано 28 мышей - 21 взрослых и 7 детенышей (табл. 1).

Таблица 1

Детали экспериментального плана и срок сохранения метки лабораторными белыми мышами

Table 1 Details of the experimental design and the time of the label retention by laboratory white mice

*Жирным шрифтом выделены данные по тем особям, на примере которых авторам удалось дождаться исчезновения метки (в числителе - при наблюдении живого зверька без использования микроскопа; в знаменателе - результат посмертной диагностики с применением микроскопа). В остальных случаях опыт был прекращен до исчезновения метки. В двух случаях (№ 3, № 12) животных забивали спустя несколько дней после того, как метку не удавалось обнаружить на живом зверьке

Процедуру выявления метки проводили in vivo без обездвиживания животного (в первый день после отсадки и далее 2 раза в неделю) и post mortem после завершения опыта. Зверьков забивали либо для получения качественных фотографий экстерьера и осмотра интерьера особей на разных сроках после мечения (n=23), либо после того, как метка становилась неразличимой при осмотре живой особи (n=5). В случаях, когда опыт не прерывался намеренно, день последней проверки, когда метка еще была видна, определял ее “срок сохранения” для данной особи.

Для выявления метки мы использовали зеленый лазер (общедоступную лазерную указку; Z=532±20 нм) в качестве источника волны возбуждения флуоресценции. Лазер был доработан - установлен рассеиватель из тонкой белой пластмассы для получения широкого светового пятна. Спектр эмиссии родамина B выделяли с помощью оранжевого стекла ОС-14, размещенного перед глазами исследователя или на объективе микроскопа или фотоаппарата (рис. 1).

В качестве фильтра эмиссии были опробованы и другие материалы (неспециализированные образцы оранжевого стекла и пластика; стоматологические очки “Glacubora monoart glasses cube orange” EURONDA, Тайвань). Детекцию метки и in vivo, и post mortem проводили в темной комнате. Для посмертной диагностики использовали микроскоп МБС-1 (ЛОМО, СССР). Полученные фотографии не подвергались никаким видам цветовой коррекции.

Рис. 1 Принципиальная схема предлагаемого способа детекции родамина B в биологических образцах

Fig. 1 Schematic diagram of the proposed method for rhodamine B detection in biological specimens

Результаты

Предложен новый способ детекции родамина B в теле животных. В ходе тестирования метода для проверки возможности его дальнейшего использования при массовом мечении были также получены сопутствующие результаты.

Мечение

В ходе непосредственных наблюдений выяснилось, что лабораторные мыши в большинстве случаев охотно поедают приманку с маркером, начиная кормиться в течение 1-2 мин после ее получения и обычно съедая всю за ночь. Лишь одна особь в первые сутки отказалась от приманки, но съела все на вторые сутки.