С помощью фермента геликазы, развивающего водородные связи, двойная спираль ДНК расплетается в точках начала репликации. Образующиеся при этом одинарные цепи ДНК связываются специальными дестабилизрующими белками, которые растягивают остовы цепей, делая их азотистые основания доступными для связывания с комплементарными нуклеотидами ,находящимися в нуклеоплазме. На каждой из цепей, образующихся в области репликационной вилки, при участии фермента ДНК-полимеразы осуществляется синтез комплементарных цепей. В процессе синтеза репликационные вилки движутся вдоль материнской спирали в противоположных направлениях, захватывая всё новые зоны.
Разделение спирально закрученных цепей родительской ДНК ферментом геликазой вызывает появление супер витков перед репликационной вилкой. Это объясняется тем, что при расхождении каждых 10 пар нуклеотидов, образующих один виток спирали, родительская ДНК должна совершить один полный оборот вокруг своей оси. Следовательно, для продвижения репликационной вилки вся молекул ДНК перед ней должна была быстро вращаться, что потребовал бы большой затраты энергии. В деятельности это не наблюдается благодаря особому классу белков ,называемых ДНК-топоизомеразами. Топоизомераза разрывает одну из цепей ДНК, что даёт ей возможность вращаться вокруг второй цепи. Это ослабляет накопившееся напряжение в двойной спирали ДНК.
К высвобождающимся водородным связям полинуклеотидных последовательностей разделённых родительских цепей присоединяются свободные нуклеотиды из нуклеоплазмы, где они присутствуют в виде дезоксирибонуклеинозидтрифосфатов:дАТФ;дГТФ;дЦТФ;дТТФ. Комплементарный нуклеозидтрифосфат образует водородные связи с определенным основанием материнской цепи ДНК. Затем при участии фермента ДНК-полимеразы он связывается фосфодиэфирной связью с предшествующим нуклеотидом вновь синезируемой цепи, отдавая при этом неорганический пирофосфат.
Поскольку ДНК-полимерза присоединяет очередной нуклеотид к ОН-группе в 3-положении предшествующего нуклеотида, цепь постепенно удлиняется на её 3'-конце.
Особенностью ДНК-полимеразы является её неспособность начать синтез новой полинуклеотидной цепи путём простого связывания двух нуклеозидтрифосфатов :необходим 3-ОН-конец какой-либо полинуклеотидной цепи, спаренной с матричной цепью ДНК, к которой ДНК-полимераза может лишь добавлять новые нуклеотиды. Такую полинуклеотидную цепь называют затравкой или праймером.
Роль затравки для синтеза полинуклеотидных цепей ДНК в ходе репликации выполняют короткие последовательности РНК, образуемые при участии фермента РНК-праймазы. Указанная особенность ДНК-полимеразы означает, что матрицей при репликации может служить лишь цепь ДНК, несущая спаренную с ней затравку, которая имеет свободный 3-ОН-конец. Способность ДНК-полимеразы осуществлять сборку полинуклеотида в направлении от 5' к 3' концу при антипараллельном соединении двух цепей ДНК означает, что процесс репликации должен протекать на них по-разному. Действительно, если на одной из матриц (3->5) сборка новой цепи происходит непрерывно от 5' к 3'-концу и она постепенно удлиняется на 3-конце,то другая цепь, синтезируемая на матрице(5->3) должна была бы расти от 3 к 5 концу. Это противоречит направлению действия фермента ДНК-полимеразы.
В настоящее время установлено, что синтез второй цепи ДНК осуществляется короткими фрагментами (фрагмент Оказаки) также в направлении от 5' к 3' концу.
У прокариот они значительно короче (от 100-до 200 нуклеотидов). Синтезу каждого такого фрагмента предшествует образование РНК-затравки длиной около 10 нуклеотидов. Вновь образованный фрагмент с помощью фермента ДНК-лигалазы соединяется с предшествующим фрагментом после удаления его РНК-затравки.
В связи с указанными особенностями репликационная вилка является ассиметричной. Из двух синтезируемых дочерних цепей одна строится непрерывно, её синтез идёт быстрее и эту цепь называют лидирующей. Синтез другой цепи идёт медленнее, так как она собирается из отдельных фрагментов, требующих образования, а затем удаления РНК-затравки. Поэтому такую цепь называют запаздывающей. Хотя отдельные фрагменты образуются в направлении 5'->3',в целом эта цепь растёт в направлении 3'->5'.
В виду того, что от локуса как правило начинаются две репликационные вилки, идущие в противоположных направлениях, синтез лидирующих цепей в них идёт на разных цепях материнской ДНК.
Конечным результатом процесса репликации является образование двух молекул ДНК, нуклеотидная последовательность которых идентична таковой в материнской двойной спирали ДНК. Рассмотренная последовательность событий, происходящих в ходе репликативного синтеза, предполагает участие целой системы ферментов :геликазы, топоизомеразы, дестабилизирующих белков, ДНК-полимеразы и других, совместно действующих в области репликационной вилки.
Репликация ДНК у про- и эукариот в основных чертах протекает сходно, однако, скорость синтеза у эукариот (коло 100нуклеотидов/с) на порядок ниже, чем у прокариот (1000 нуклеотидов/с).
Причиной этого может быть образование ДНК эукариот достаточно прочных соединений с белками, что затрудняет её деспирализацию, необходимую для осуществления репликативного синтеза.
Фрагмент ДНК от точки начала репликации до точки её окончания обрзует единицу репликации - репликон. Однажды начавшись в точке начала, репликация продолжается до тех пор, пока весь репликон не будет дуплицирован. Кольцевые молекулы ДНК прокариотических клеток имеют один локус и представляют собой целиком отдельные репликоны. Эукариотические хромосомы содержат большое число репликонов. В связи с этим удвоение молекулы ДНК, расположенной вдоль эукариотической хромосомы ,начинается в нескольких точках. В разных репликонах удвоение может идти в разное время или одновременно.
Для поддержания главных характеристик клетки или организма на протяжении их жизни ,а также в ряду поколений наследственный материал должен отличаться устойчивостью к внешним воздействиям или должны существовать механизмы коррекции возникающих в нем изменений. В живой природе используются оба фактора. Третьим фактором является точность копирования нуклеотидных последовательностей материнской ДНК в процессе её репликации.
По репликационной способности молекулы ДНК относятся к категории химически инертных веществ
2. Периоды репликации
Для репликации характерны три периода:
1.Инициация
2.Элонгация
3.Терминация
2.1 Инициация
Репликация начинается в нескольких точках молекулы ДНК. Это связано с тем, что размер генома типичной клетки млекопитающий составляет около 109 пар нуклеотидов. В ДНК средней по величине хромосомы человека содержится несколько десятков миллионов па нуклеотидов. При скорости репликации примерно 1000 пар нуклеотидов в минуту для полного завершения репликации молекулы ДНК в хромосоме понадобится несколько суток. Для клетки такой срок репликации генома совершенно не приемлем, так как во время репликации ДНК не осуществляется важный процесс - транскрипция РНК. Оба процесса- синтез ДНК и РНК, с их громоздким ферментативным обеспечением, одновременно на матрице происходить не могут. Поэтому в момент репликации происходит частичное выключение транскрипции. Это само по себе опасно, так как отсутствие экспрессии генов приводит к недостатку белков-ферментов, и следовательно, к нарушению нормального течения метаболизма. Это опасный для клетки момент в какой-то мере нивлируется тем, что в период предсинтеза ДНК в цитоплазме клетки заранее накапливается достаточно материала для поддержания экспрессии генов в период репликации
ДНК на необходимом для жизнедеятельности клетки уровне. Поэтому во время синтеза ДНК трансляция осуществляется, транскрипция же практически не идёт. Понятно, что в этих условиях необходимы механизмы, которые до предела сократили бы время репликации ДНК хромосом. Один из таких механизмов, созданный в эволюции, достаточно прост-репликация начинается одновременно в нескольких точках молекулы ДНК. Приблизительные расчёты показали, что в молекуле ДНК одной хромосомы таких точек может быть до нескольких тысяч. Такое большое количество мест, с которых начинается репликация ДНК хромосомы, несомненно, существенно сокращает время её синтеза. Точки, в которых начинается репликация, носит название точки начала репликации или ориджин, орисайт. Эти точки представляют собой небольшие участки ДНК с определённой специфической последовательностью нуклеотидов. Начальным моментом репликации является присоединение к ори-сайтам специальных белков-инициаторных белков.
Два положения ори-сайтов. Во-первых, репликация начинается не со всех точек одновременно. В одних точках она может пройти значительный участок, а в других только начаться. Во-вторых, от ори-сайтов процесс синтеза ДНК может двигаться в одном направлении или сразу в обоих, противоположных направлениях- двунаправленная репликация. У эукариот чаще всего наблюдается второй тип репликации.
Наличие ори-сайтов привело к созданию понятия репликон. Репликон -это фрагмент матричной ДНК на котором идёт автономный синтез дочерней ДНК. Он начинается с точки репликации и заканчивается отточкой, где фермент заканчивает репликацию.
У репликона три основных свойства:
1.Он автономен.
2.Обеспечивет процесс синтеза ДНК.
3.Имеет собственное ферметативное обеспечение.
Если репликация однонаправлена, то протяжённость репликона соответствует промежутку между ори -сайтами, например репликон Б-В. Если же репликация двунаправлена (например, между ори-сайтами Г-Д), то между этими точками будут располагаться два репликона Г-Е и Д-Е, где Е-конец двух различных прцессов репликации имеющих собственное ферментативное обеспечение. Как показали эксперименты, определить среднюю протяжённость одного репликона, достаточно трудно. Чаще всего за репликон принимают последовательность ДНК, ограниченную двумя ори-сайтами.
В точке начала репликации происходят, события которые связаны с присоединением к инициаторному белку других ферментов запускающих целый ряд подготовительных процессов. В соответствии с очередностью эти события располагаются в следующем порядке:
1.Образование репликационной вилки.
2.Образование РНК-затравки
Образование репликационной вилки происходит в точках начала репликации. Вилка репликации представляет собой отошедшие друг от друга свободные нити матричной ДНК, на которых происходит синтез дочерних нитей ДНК. Две вилки репликации образуют глазок репликации.
В обоих вилках репликации происходит синтез ДНК в противоположых направлениях. В глазке репликации вилки двигаются, расплетая ДНК в противоположных направлениях.
Образованию вилок репликации предшествует целый ряд подготовительных процессов, которые, как правило, располагаются в следующем порядке.
- Освобождение молекулы ДНК от связи с гистонами в нуклеосоме.
- Деспирализация ДНК.
- Разрыв водородных связей между нитями матричной ДНК.
- Расхождение нитей ДНК.
- Фиксация матричных нитей ДНК.
Освобождение молекулы ДНК от связи с гистонами необходимого элемента периода инициации. В ядре клеток ДНК практически никогда не находится в свободном состоянии. Она связана с гистоновыми белками тетрамера и гистоном Н1. Кроме того, с ДНК взаимодействуют различные негистоновые белки, двухвалентные металлы, липиды и другие соединения. Всё это приводит к сильной спирализации отдельных участков ДНК в предсинтетическом периоде. В основе процесса освобождения ДНК от связей с окружающими молекулами лежит несколько химических реакций осуществляемых ферментами- метилирование, ацетилирование и фосфолирование положительно заряженных групп гистоновых и негистоновых белков. В результате белки теряют положительный заряд, их связи с отрицательно заряженной молекулой ДНК становятся слабыми. Это способствует высвобождению ДНК.
Сразу же после освобождения о связей с белком происходит процесс деспирализации ДНК. Этот процесс необходим для последующего освобождения нитей ДНК от связи друг с другом. Важное значение имеет и другой процесс. Нити молекулы ДНК не просто лежат параллельно друг другу, они взаимно закручены. Существует множество способов раскрутки спиралей. При фиксации одного конца и разведение противоположных концов создаются дополнительные силы, приводящие к формированию вторичных супер спиралей. При втором способе раскручивание приведёт к вращению свободного конца, а это может превратить ядро в субмолекулярный миксер, что не безопасно для клетки. Репликативный глазок (состоит из двух репликативных вилок).
Принцип раскручивания спирали до конца не ясен. Суть его в том, что специальный фермент производит временный одноцепочечный разрыв в одной нити ДНК. И через этот разрез происходит противоположная нить ДНК. При этом один виток спирали расплетается. Затем разрез ликвидируется. Процесс разрезания, расплетения и сшивки может повторяться множество раз по мере продвижения репликационной вилки по молекуле ДНК.