ИССЛЕДОВАНИЕ ПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА КЛЕТОК, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОПТАТОВ КОЖИ ЧЕЛОВЕКА И ТКАНЕЙ ОЖОГОВОЙ РАНЫ

травма термический ожоговый заживление

А. Н. Харламова, О. В. Петракова И. Е. Гурманчук

Белорусский государственный медицинский университет,

г. Минск, РБ, www.nastya.kharlamova@ki.se

Термическая травма занимает ведущее место по летальности среди других видов травм. С учетом того, что состояние раны во многом определяется уровнем активности иммунной системы, нами была выдвинута гипотеза о том, что в процессе заживления немаловажное значение имеет оценка состояния раневой поверхности ожоговой раны, а также определение критических факторов сопряженных с эффективной и качественной репарацией.

Материалы и методы исследований. Для выделения лимфоцитов из интактных участков кожи, участков грануляции и гипергрануляции применяли классический способ, который подразумевает использование ферментов, а именно колагеназы, гиалуронидазы и ДНКазы. Материал (фрагмент кожи весом 0,5 грамм) погружали на 2 часа в раствор Хенкса, содержащий 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Затем разрезали на мелкие фрагменты и помещали в раствор комплекса ферментов (коллагеназы, гиалуронидазы, ДНКазы I) в RPMI-1640 c 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина. После 18 часовой (10 часовой, в случае выделения клеток из участков грануляции/гипергрануляуии) инкубации, суспензию клеток отбирали и отмывали дважды в растворе Хенкса, содержащем 2% эмбриональной телячьей сыворотки. На заключительном этапе полученную суспензию клеток центрифугировали на градиенте Ficoll-Paque, полученные клетки отмывали, оценивали их количество, состав и жизнеспособность (с помощью 0,2% трипанового синего).

Исследование экспрессии поверхностных маркеров на выделенных клетках проводили на проточном цитометре Becton Dickinson FACSCalibur с использованием моноклональных антител меченых флюорохромом. Определяли следующие субпопуляции клеток: CD3бв, CD3д, CD4, CD8, HLA-DR, CD14, CD45.

Результаты исследований. Возможно как минимум три исхода заживления раны: нормальное, вялотекущее и с образованием гипертрофических рубцов. Участие иммунных факторов сопровождает все варианты заживления. При сбалансированном соотношении регенерации и воспаления происходит оптимальное заживление раны и образование грануляционной ткани. Исследование фенотипических характеристик полученных клеток показало (табл.1), что из участков грануляции на долю лейкоцитов (CD45) приходится около 83% от всех выделяемых клеток. Что касается субпопуляций Т-лимфоцитов, то на долю CD3бв приходится 36%, а на долю CD3д - 6%, цитотоксические лимфоциты составляют 3% от общей популяции лейкоцитов. При этом на долю CD14 приходится около 10%, а на клетки, экспрессирующие на своей поверхности HLA-DR лишь 2% от общей популяции лейкоцитов.

Таблица1. Популяционный состав клеток раневой поверхности и интактной кожи человека

* - отличия достоверны между интактной кожей и грануляцией, р<0,05

** - отличия достоверны между грануляцией и гипергрануляцией, р<0,05

*** - отличия достоверны между интактной кожей и гипергрануляцией, р<0,05

Одним из вариантов патологического течения репаративного процесса является разрастание соединительной ткани и образование т.н. участков гипергрануляции, которая выдавливается на уровне окружающей кожи и фактически блокирует реэпителизацию. Гипергрануляция характеризуется высокой степенью содержания клеточных элементов и нарушением механизма апоптоза клеток. В ходе работы из участков с гипергрануляцией удалось обнаружить около 75,5% лейкоцитов (CD45) от общего количества всех выделенных клеток, из которых CD3бв составляли 40%, CD3д - 2,6%, на долю CD8 лимфоцитов приходится 20%, а на клетки, несущие на своей поверхности HLA-DR - 20,7%. Популяций лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD4 молекулу не в участках грануляций не в участках гипергрануляций найдено не было (табл.1).

Что касается участков интактной кожи, то при фенотипировании клеток, показано, что на долю лейкоцитов (CD45) приходится около 14% от всех выделенных из биопатата кожи клеток. При этом около 12% составляют лимфоциты, несущие CD3бв. На долю же гд+ Т-лимфоцитов приходится около 10%, а на долю CD8 лимфоцитов приходится 12% от популяции лейкоцитов (табл.1).

Выводы

Таким образом, при «нормальном» процессе репарации с образованием грануляционной ткани, раневой инфильтрат характеризуется достаточно большим количеством лейкоцитов по сравнению с интактным участком кожи. Гипергрануляции характеризуются значительным увеличением количества клеток, экспрессирующих HLA-DR. В целом в составе инфильтратов участков гипергрануляций регистрировалось также большее количество цитотоксических лимфоцитов по сравнению с участками грануляционной ткани. А количество Т-лимфоцитов, имеющих TCR гд было значительно меньше чем в инфильтратах с грануляциями.

Дальнейшее изучение фенотипических и других параметров лейкоцитов, а также их соотношений в инфильтратах раны позволит прогнозировать течение репаративного процесса.