ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»
ФГБУН «Зоологический институт Российской академии наук»
Диагностика стронгилидозов органов пищеварения у лошадей
Гаврилова Надежда Алексеевна, д. вет. наук, профессор кафедры паразитологии им. В. Л. Якимова
Логинова Ольга Александровна, канд. вет. наук, ассистент кафедры паразитологии им. В. Л. Якимова
Миролюбов Алексей Александрович, м. н. с., лаборатория по изучению паразитических червей и протистов
Ситникова Раиса Сергеевна, аспирант кафедры паразитологии им. В. Л. Якимова
Аннотация
Копроовоскопическими исследованиями лошадей, содержащихся в конно-спортивном клубе Ломоносовского района Ленинградской области, установлена экстенсивность инвазии стронгилидами органов пищеварения 60,8 % и интенсивность инвазии средней степени (от 67,2±5,1 до 165,2±3,3 яиц в 1 г фекалий). Световой микроскопией при помощи микроскопа «Микмед-6» (ЛОМО, Россия) проведена идентификация культивированных личинок стронгилид по морфологическим признакам. Установлена принадлежность стронгилид к двум родам - Cyathostoma и Delafondia. Для идентификации личинок рода Delafondia учтено число кишечных клеток, гофрированность, длина пищевода, соотношение длины тела к длине хвостового конца. Сканирующей электронной микроскопией на оборудовании центра коллективного пользования «Таксон» подтверждена принадлежность личинок к роду Cyathostoma, определен участок прикрепления хвостового конца у личинки, который у ряда культивированных личинок может отсутствовать. При обнаружении личинок деляфондий у спортивных лошадей следует давать осторожный прогноз их дальнейшего использования в спортивной карьере, так как сформированные в сосудах брюшной полости тромбы и аневризмы приводят к развитию геморрагического инфаркта, и эти тромбы и аневризмы при преодолении препятствий лошадьми могут вызывать ущемления и завороты кишечных петель с последующим их разрывом.
Ключевые слова: личинка, паразитическая нематода, лошадь
Summary
DIAGNOSTICS OF THE GASTRO-INTESTINAL STRONGYLIDOSES IN HORSES
Saint Petersburg State Academy of Veterinary Medicine
Zoological Institute of the Russian Academy of Sciences
Gavrilova Nadezhda Alekseevna, Doctor of Veterinary Science, Professor of the Dept. of Parasitology.
Loginova Olga Aleksandrovna, PhD of Veterinary Science, Assistant of the Dept. of Parasitology.
Miroliubov Aleksei Aleksandrovich, junior researcher, Laboratory of parasitic flat worms andprotists.
Sitnikova Raisa Sergeevna, post-graduate student of the Dept. of Parasitology.
Due to coproovoscopic studies of horses kept in the equestrian sport club in the Lomonosovsky district of the Leningrad region, it was found that gastro-intestinal strongylids infestation prevalence rate was 60.8 % and infection intensity was moderate (from 67.2 ± 5.1 to 165.2 ± 3.3 eggs per 1g of feces). By means of light microscopy using a “Mikmed-6” microscope (LOMO, Russia) we carried out identification of cultured Strongylid L3 larvae based on their morphological characters. Obtained strongylids belong to two genera - Cyathostoma and Delafondia. To identify the larvae of the Delafondia sp. we must take into account the number of its intestinal cells, corrugation, length of the esophagus, and the ratio of its body length to the length of its caudal end. Scanning electron microscopy performed on the equipment of the Taxon Collective Use Center allowed us to confirm that the larvae cultured belong to the genus
Cyathostoma, and to determine the attachment site for the tail end of the larva, which may be absent in a number of cultivated larvae. Once Delafondia larvae are detected in sports horses, a careful prediction of their further use in a sports career should be given, since blood clots and aneurysms formed in the vessels of the abdominal cavity lead to the development of hemorrhagic infarction, which when horse jumps over the barrier, can cause entanglements and inversion of intestines, followed by their rupture.
Key words: larva, parasitic nematode, horse
Введение
Несмотря на изменившиеся условия содержания лошадей и усовершенствованные методы диагностики гельминтозов, немато- дозы (в частности, стронгилидозы желудочно-кишечного тракта), по ряду причин остаются распространенными инвазиями как в Российской Федерации, так и во всем мире [1, 2, 5, 8]. Способствует их широкому распространению то, что животные, находящиеся преимущественно на стойлово-выгульном содержании на мелких и средних конефермах, в конно-спортивных клубах, выпасаются ежегодно на одних пастбищах на протяжении длительного времени. Бесконтрольное перемещение лошадей между различными конно-спортивными клубами также способствует заносу и распространению инвазии [2, 6]. Проведение дегельминтизации препаратами, содержащими действующие вещества из одной химической группы, приводит к формированию у паразитов резистентности. Так, с появлением устойчивости у паразитических нематод к бензимидазольным препаратам, основной группой антигельминтиков в коневодстве стали макроциклические лак- тоны, которые уже в последние годы не дают желаемого терапевтического эффекта [3, 5, 7, 8]. Дегельминтизация проводится в большинстве случаев без учета биологии возбудителей, что способствует формированию и сохранению инвазионных стадий гельминтов во внешней среде.
По литературным данным у лошадей зарегистрировано 63 вида стронгилид, относящиеся к 21 роду и двум п/сем. Strongylinae и Cyathostominae (Trichonematinae). По своему патогенному влиянию на организм хозяина они составляют одну из наиболее экономически важных групп паразитов. Из стронгилид особенно патогенными являются представители таких родов, как: Strongylus, Alfortia, Delafondia, Cyathostoma (Trichonema), которые опасны в имагинальной и ларвальной стадиях развития [5, 9]. Длительный период миграции личинок стронгилид в различные органы и ткани приводит в ряде случаев к необратимым последствиям, что важно учитывать при эксплуатации лошадей, особенно спортивного профиля. Так, последствия миграции личинок стронгилид рода Delafondia нередко приводят к формированию тромбов, спаек в брюшной полости, что может привести к летальному исходу при активной физической нагрузке, особенно у конкурных лошадей.
Целью наших исследований стало определение родовой принадлежности стронгилид лошадей, принадлежащих конно-спортивному клубу, расположенному в Ленинградской области, для прогноза использования животных в спортивной карьере.
Материалы и методы
Свежевыделенные фекалии лошадей были собраны от 23 особей, содержащихся в конно-спортивном клубе (КСК), расположенном в д. Дятлицы Ломоносовского района Ленинградской области. Каждую пробу фекалий делили на две части. Одну часть пробы фекалий исследовали модифицированным методом Дарлинга с использованием универсальной флотационной жидкости [1]. Вторую часть подвергли культивированию с целью получения личинок третьей стадии. Микроскопическое исследование осадка на предмет обнаружения личинок гельминтов проводили по методике, усовершенствованной О. А. Логиновой и Л. М. Беловой [10].
Для подсчета яиц в 1 г фекалий использовали счетную камеру, разработанную Л. И. Ми- гачевой и Г. А. Котельниковым (1987). Число яиц, выявленных в одной ячейке, при сильной интенсивности инвазии умножали на коэффициент 60 (в расчете на объем 30 мл), при слабой - на расчетный коэффициент 38 [4].
Идентификациюличинок стронгилид проводили по морфологическим признакам, включая длину пищевода, форму и количество кишечных клеток, длину хвостового конца. Световую микроскопию методом светлого поля проводили при помощи микроскопа «Микмед-6» (ЛОМО, Россия). Съемку осуществляли при помощи зеркальной фотокамеры 5D Mark II (Canon, Япония) и оптико-механического адаптера (ЛОМО, Россия). Определение линейных размеров проводили в программе ImageJ с предварительной калибровкой по объект-микрометру ОМП (ЛОМО, Россия).
Морфологические исследования с использованием сканирующего электронного микроскопа были выполнены на оборудовании центра коллективного пользования «Таксон» (http://www.ckp-rf.ru/ckp/3038/) «Taxon» Research Resource Center (http:// www.ckp-rf.ru/ckp/3038/)]. Подготовку личинок выполнили путем погружения их в жидкость Буэна с последующей отмывкой в спиртах возрастающей чистоты и финальной промывкой в ацетоне. После проведения сушки в критической точке на аппарате CPD-2 (Hitachi, Япония) на личинок нанесли слой платины при помощи ионного на- пылителя IB-5 (Eiko Engineering, Япония). Сканирующую электронную микроскопию осуществляли в рамках тем государственных заданий № АААА-А17-П7030310322-3 и AAAA-A19-119020690109-2 в лаборатории по изучению паразитических червей и протестов ЗИ РАН при помощи микроскопа Quanta SEM 250 (Thermo Fisher Scientific, США). Изображения получены в программе XT Microscope Control.
Результаты исследований
У 14 лошадей (экстенсивность инвазии 60,8 %) различных пород: арабская, латвийская, русский рысак, полукровная спортивная, вестфальская, англо-рысистая, арабо-таганская, а также беспородных, в возрасте от 12 месяцев до 17 лет, гельминтоовоскопиче- ским методом установлена средняя степень инвазии стронгилидами органов пищеварения (от 67,2±5,1 до 165,2±3,3 яиц в 1 г фекалий). Все обнаруженные в фекалиях яйца были овальной формы, размером от 72 до 95 мкм, серого цвета, с тонкой двухконтурной оболочкой, на стадии морулы с бластомерами. Дифференцировать яйца стронгилид органов пищеварения достаточно сложно, так как они имеют схожие морфологические характеристики. Определяли род стронгилид органов пищеварения лошадей по строению инвазионных личинок (L3) гельминтов.
У 14 лошадей были обнаружены личинки длиной до 0,5 мм, имеющих прямой, тонкий, шиловидный хвостовой конец чехлика. Соотношение тела личинки к хвостовому концу составляло 1,5:1. Кишечник личинки имел 8 клеток треугольной формы. Пищевод был длинный и узкий, несколько расширен в задней части. По характерным морфологическим признакам были идентифицированы личинки как представители рода Cyathostoma (Trichonema) (Рис. 1 А).
На микроснимках, полученных при помощи сканирующей электронной микроскопии, хорошо различима гофрированность, длинный хвостовой конец, характерные для циатостомид (Рис. 1 Б). На головном конце паразитической личинки циатостомы ротовой воротник не отделен от остальной части тела, радиальная корона у верхнего его края слабо выражена. (Рис. 1 В)
Рис 1. Личинка L3 рода Cyathostoma (Trichonema)
А - общий вид личинки, головной конец обращен вправо (1-8 - кишечные клетки; П - пищевод; ХКЛ - хвостовой конец личинки; ХКЧ - хвостовой конец чехлика), светлопольная световая микроскопия, ув. х20 (по объективу); Б - общий вид личинки (ЛЖ - лотеральный желоб), сканирующая электронная микроскопия; В - увеличенный головной конец личинки (РО - ротовое отверстие, окруженное тремя губами; РС - ротовые сосочки), СЭМ.
У 4 животных, кроме личинок трихонем, были выявлены личинки, тело которых было заключено в чехлик с хорошо выраженной гоф- рированностью, с длинным хвостовым концом, составляющим 1/3 часть тела личинки. Пищевод личинки длинный, занимающий 1/4 часть длины тела, кишечник состоял из 16 хорошо различимых кишечных клеток. Возникла необходимость провести дифференциацию личинок деляфондии и стронгилюса. Несмотря на то, что личинка стронгилюса имеет также 16 кишечных клеток, пищевод у нее короткий и занимает 1/8 часть длины тела личинки, чехлик имеет малозаметную гофрированность, кишечные клетки мало различимы и соотношение тела личинки к хвостовому концу составило 2,8:1. На основании анализа полученных данных личинка была отнесена к роду Delafondia (Рис. 2).
Рис 2. Общий вид личинки L3 рода Delafondia
1-16 - кишечные клетки, П - пищевод; ПЗ - половой зачаток;
ХКЛ - хвостовой конец личинки; ХКЧ - хвостовой конец чехлика (светлопольная световая микроскопия, увеличение х10 по объективу).
Следует отметить, что в полученном материале были обнаружены личинки, имеющие все характерные морфологические признаки рода Cyathostoma (Trichonema), у которых отсутствовал хвостовой конец (Рис. 3 А-Б). инвазия стронгилиды личинка пищеварение
Анализируя микроснимки, полученные при помощи сканирующей электронной микроскопии, было установлено место крепления хвостового конца к телу личинки, которое в ряде случаев позволяет этой части личинки отделяться (Рис. 3 В).
Рис 3. Личинка L3 рода Cyathostoma (Trichonema)
А - общий вид личинки с отсутствующим хвостовым концом (П - пищевод, ПЗ - половой зачаток; КК - кишечные клетки), светлопольная световая микроскопия, ув. х20 (по объективу) ; Б - увеличенный фрагмент каудальной части личинки (КК - кишечная клетка; ХК - хвостовой конец), световая микроскопия с освещением сверху, ув. х40 (по объективу); В - увеличенный фрагмент каудальной части личинки (ЛЖ - латеральный желоб; МКНЧХ - место крепления нитевидной части хвоста), СЭМ.
Обсуждение результатов
Диагностика стронгилидозов органов пищеварения у лошадей проведена гельминтоовоскопическими и гельминтолар- воскопическими методами. Флотационные гельминтоовоскопические методы позволили выявить инвазированных животных, установить экстенсивность и интенсивность инвазии, но не дали возможности установить род возбудителя и поставить точный диагноз. Ларвоскопическими методами у лошадей, содержащихся в конно-спортивном клубе в Ленинградской области, были выявлены, а в дальнейшем идентифицированы (по соотношению длины тела и хвостового конца, количеству кишечных клеток, длине пищевода) личинки стронгилид, принадлежащие к двум родам - Cyathostoma и Delafondia.
Необходимо помнить, что после алиментарного попадания инвазионных личинок в организм животных и проникновения в стенку слепой и ободочной кишок происходит формирование узелка, который сохраняется до 1,5-2 месяцев («узелковый колит»). После двукратной линьки в узелке личинка выходит в просвет кишки, разрывая оболочку, открывая «ворота инфекции», что сопровождается клиническими симптомами колик.
Личинки циатостом были обнаружены как с длинным хвостовым концом, так и с отсутствующим хвостовым концом. Сканирующая электронная микроскопия дала возможность установить участок прикрепления хвостового конца к телу личинки и понять, как происходит его открепление.