Статья: Анализ взаимодействия производного диазепино [1,2-а] бензимидазола соединения ДАБ-21 с основными лигандами нейромедиаторных систем

АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОИЗВОДНОГО ДИАЗЕПИНО [1,2-а] БЕНЗИМИДАЗОЛА СОЕДИНЕНИЯ ДАБ-21 С ОСНОВНЫМИ ЛИГАНДАМИ НЕЙРОМЕДИАТОРНЫХ СИСТЕМ

Д.В. Мальцев, А.А. Спасов, М.В. Мирошников, М.О. Скрипка, Ю.Ю. Дементенко, Е.М. Черникова

ФГБОУ ВО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакологии и биоинформатики;

ГБУ «Волгоградский медицинский научный центр», лаборатория экспериментальной фармакологии

Для соединения под шифром ДАБ-21 показан выраженный нейропсихотропный потенциал. В настоящем исследовании рассмотрены возможные направления влияния изучаемой субстанции на базовые медиаторные системы ЦНС. По результатам исследования было обнаружено бензодиазепиноподобное действие ДАБ-21 в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» с флумазенилом, потенциирование эффектов фенамина, некоторый серотонинактивирующий эффект в тесте с 5-ГТФ, слабый адреноблокирующий эффект, выявленный с помощью теста «Клофелиновая гипотермия». Также выявлен 02-активирующий эффект по данным теста с галоперидолом, слабый М-холинолитический эффект в тесте с ареколином и слабое МАО-ингибирующее действие, предполагаемого на основании антагонизма с резерпином, а также результатов теста с L-ДОФА. Для соединения не отмечено взаимодействия с никотином и апоморфином. Нейромедиаторный профиль соединения ДАБ-21 представляет интерес для дальнейшего изучения и уточнения механизма действия данного вещества.

Ключевые слова: ДАБ-21, новые соединения, анксиолизис, депрессия, in vivo, ГАМК, 5-ГТФ, фенамин, L-ДОФА.

ANALYSIS OF INTERACTION OF THE DIAZEPIN0 [L,2-A] BENZIMIDAZ0LE DERIVATIVE COMPOUND DAB-21 WITH THE MAIN NEUROMEDIATOR SYSTEMS LIGANDS

D.V. Maltsev, A.A. Spasov, M. V. Miroshnikov, M.O. Skripka, Yu. Yu. Dementenko, E.M. Chernikova

FSBEI HE «Volgograd State Medical University» of the M inistry of Healthcare of the Russian Federation, Department of pharmacology and bioinformatics

SBI «Volgograd Medical Research Center», laboratory ofexperimental pharmacology

For the substance under the code DAB-21, a pronounced neuropsychotropic potential was previously shown. In this study, possible directions of the influence of the studied substance on basic mediator systems of the CNS are considered. According to the results of the study, a benzodiazepine-like effect of DAB-21 was found in the «Elevated plus maze» test with flumazenil, as well as potentiation of the effects of phenamine, and some serotoninergic effect in the test with 5-GTP, and a weak a2-adrenoblocking effect, revealed using the «Clofelinic hypothermia» test. There was also a D2-activating effect according to the haloperidol test, a weak M-anticholinergic effect in the arecoline test. Some MAO-inhibitory effect was found, suggested by antagonism with reserpine, as well as the results of the L-DOPA test. The compound did not interact with nicotine and apomorphine. The neurotransmitter profile of the compound DAB-21 is of interest for further study and clarification of the mechanism of action of the substance.

Key words: DAB-21, new compounds, anxiolysis, depression, in vivo, GABA, 5-HTP, phenamine, L-DOPA.

В ранее проведенных исследованиях была показана перспективная анксиолитическая и антидепрессивная активности производного диазепино[1,2-а] бензимидазола под шифром ДАБ-21 [2, 4].

Для производных диазепина характерны выраженные нейропсихотропные свойства, в то время как для бензимидазолов отмечены противомигренозные, психостимулирующие, противосудорожные и многие другие фармакологические эффекты [3].

Ввиду большого разнообразия спектров фармакологической активности привилегированных подструктур, входящих в состав изучаемой субстанции, становится очевидна необходимость проведения фармакологического анализа соединения на возможность проявления различных нейромедиаторных взаимодействий.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить возможные взаимодействия соединения ДАБ-21 с основными лигандами нейромедиаторных систем методами фармакологического анализа in vivo.

МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводились на 224 белых аут-бредных мышах-самцах массой 18-22 г и 16 белых аутбредных крысах-самцах массой 160-180 г, полученных из ФГУП «ПЛЖ «Рапполово» (Ленинградская обл., Россия), разделенных методом случайного выбора на равные группы (п = 8). Животные содержались в условиях вивария с естественным световым режимом на стандартной пищевой диете лабораторных животных без ограничения доступа к еде и воде (ГОСТ Р 50258-92), с соблюдением «Международных рекомендаций по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях» (2017). Выполнение работы соответствует параметрам по доклиническим исследованиям (Приказ Минздрава России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики», зарегистрировано в Минюсте России 15.08.2016 № 43232). Производное диазепино[1,2-а]бензимидазола соединение ДАБ-21 синтезировано НИИ ФОХ ЮФУ г. Ростова-на-Дону [1].

При исследовании возможного взаимодействия ДАБ-21 с базовыми нейромедиаторными системами использовались методики in vivo, позволяющие оценить активность субстанции ДАБ-21 в отношении адренергической, серотонинергической, дофаминергической, холинергической и ГАМК-ергической систем, а также МАО-ингибирующую активность соединения. Эксперименты выполнены в соответствии с «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [6].

Для первичной оценки взаимодействия ДАБ-21 с ГАМК-ергической системой использовался тест «Приподнятый крестообразный лабиринт» на мышах с применением антагониста бензодиазепиновых рецепторов флумазенила (ACS, США, 1 мг/кг). В качестве препарата сравнения использован диазепам (2 мг/кг). Доза ДАБ-21 была рассчитана эквимолярно диазепаму и составила 2,52 мг/кг. Группа контроля получала растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме: 0,1 мл на 10 г веса животного. Опытные группы получали: 1) диазепам (2 мг/кг); 2) диазепам (2 мг/кг) и флумазенил (1 мг/кг, за 30 минут до введения диазепама); 3) ДАБ-21 (2,52 мг/кг); 4) ДАБ-21 (2,52 мг/кг) и флумазенил (1 мг/кг, за 30 мин до введения ДАБ-21). Все вещества вводились мышам атравматичным зондом внутрижелудочно, тестовое наблюдение начиналось через 30 мин после их введения. Регистрировались параметры: время (с) и число выходов мышей в открытый рукав, общее число переходов, число свешиваний и болюсов.

Для выявления неспецифического катехоламинергического действия ДАБ-21 применен тест «Фенаминовая стереотипия»: 1) контрольная группа мышей получала фенамин (5 мг/кг, в/б); 2) опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения фенамина. Фиксировался латентный период возникновения беспокойства животных (мин), дл и- тельность двигательной активности (мин), а также длительность стереотипии (с). Для детализации полученных данных применялись тесты для верификации серотонинергической, дофаминергической и адренергической активностей ДАБ-21.

Для анализа влияния ДАБ-21 на серотонинергическую нейротрансмиссию использовался тест «5-гидрокситриптофанового гиперкинеза» на мышах: как известно, введение 5-ГТФ приводит к возникновению у мышей резких встряхиваний головой в результате активации 5-НТ2-рецепторов. В эксперименте использованы: 1) группа контроля (5-ГТФ, «Sigma», США, 300 мг/кг, в/б); 2) опытная группа (ДАБ-21, 2,52 мг/кг, в/ж, за 30 мин до введения 5-ГТФ). Число встряхиваний головой оценивалось каждые 10 минут в экспериментальных группах на протяжении 60 мин после введения 5-ГТФ.

Изменение дофаминергической передачи под действием ДАБ-21 оценивалось в тестах «Апоморфиновая стереотипия» и «Галоперидоловая каталепсия». В тесте «Апоморфиновой стереотипии» (мыши): 1) группа контроля получала апоморфин («ICN Biomedical», США, 1 мг/кг, в/б); 2) опытная группа - ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения апоморфина. Результаты оценивались по балльной шкале каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 мин: 0 баллов - отсутствие стереотипии, 1 балл - отдельные стереотипные движения (в том числе непостоянное принюхивание), 2 балла - наличие непродолжительно длящейся интенсивной стереотипии (в том числе лизания и грызения), 3 балла - постоянная и интенсивная стереотипия [5]. В тесте «Галоперидоловой каталепсии» оценивалась способность крыс к сохранению заданной непривычной позы. Были задействованы: 1) группа контроля (галоперидол, ЗАО «Биннофарм», Россия, 3 мг/кг, в/б); 2) опытная группа (ДАБ-21, 2,52 мг/кг, в/ж, за 30 мин до введения галоперидола). Выраженность каталепсии оценивалась в баллах каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 минут по шкале C. Morpugo (1962) [8]: 1 балл - передняя лапа крысы слегка отводится и помещается на подставку высотой 3 см; 2 балла - крыса стоит на задних лапах, одна передняя помещена на подставку высотой 10 см; 3 балла - крыса стоит на передних лапах, одна задняя лапа помещена на подставку высотой 10 см.

Оценка взаимодействия ДАБ-21 с адренергической системой производилась с помощью тестов, основанных на гипотермическом эффекте клофелина и резерпина. В тесте «Клофелиновая гипотермия» на мышах задействованы:

1) группа интактного контроля;

2) контрольная группа, получавшая клофелин (АО «Органика», Россия, 0,1 мг/кг, в/б); 3) опытная группа, получавшая ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения клофелина. Оценивалось изменение ректальной температуры мышей с помощью термодатчика AnD DT-623 (A&D, Китай) при погружении электрода на глубину 1,5-1,8 см каждые 30 мин эксперимента на протяжении 120 минут.

Тест «Резерпиновая гипотермия» на мышах включал:

1) интактный контроль;

2) контроль с резерпином («Польфа», Польша, 2,5 мг/кг, в/б); 3) опытную группу, получавшую ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения резерпина. Оценивалось изменение ректальной температуры мышей до введения резерпина, а также через 240 и 270 мин эксперимента.

Наличие МАО-ингибирующей активности ДАБ-21 проверяли тестом «Стереотипии, обусловленной L-ДОФА». Первая группа контроля получала L-ДОФА («Sigma», США, 500 мг/кг, в/ж), вторая группа контроля - L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж), опытная группа - L-ДОФА (100 мг/кг, в/ж) и ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж). Выраженность стереотипии подсчитывали в баллах через 30, 60 и 90 мин после начала эксперимента, балльная шкала была аналогична таковой для теста «Апоморфиновая стереотипия».

Для определения степени центрального М-холинергического потенциала ДАБ-21 применялся тест с ареколином, при применении которого у мышей развивались гиперсаливация и тремор: 1) контрольная группа мышей получала ареколин в дозе 15 мг/кг в/б; 2) опытная группа получала ДАБ-21 в дозе 2,52 мг/кг в/ж за 30 мин до введения ареколина. Регистрация длительности тремора (с) и латентного периода его возникновения (с) проводилась сразу после введения ареколина.

Н-холинотропный потенциал ДАБ-21 оценивался в тесте «Никотинового тремора»: 1) первая группа контроля получала никотин (2 мг/кг), в результате чего у животных развивался тремор, но судорог не наблюдалось; 2) вторая группа контроля получала никотин (4 мг/кг), что приводило к развитию судорог у 100 % мышей; 3) первая опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения никотина (2 мг/кг); 4) вторая опытная группа получала ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) за 30 мин до введения никотина (4 мг/кг). Результаты теста оценивались процентным отношением животных, у которых развивались судороги или тремор, к общему числу животных в группе.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась с применением теста Колмогорова - Смирнова с поправкой Делайла - Вилкоксона - Лилиефорса для малых выборок. Для непараметрического распределения данных применен критерий Крас- келла - Уоллиса и пост-тест Данна. Для парных сравнений использовали U-критерий Манна - Уитни. Вычисления реализованы в программе GraphPad Prism v.5.0. Результаты представлены в виде M ± SEM, p ^ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По результатам теста с флумазенилом в «Приподнятом крестообразном лабиринте» показано, что флумазенил устраняет анксиолитический эффект диазепама и ДАБ-21: время, проведенное мышами в светлом рукаве установки, снизилось практически в 20 раз для диазепама и в 10 раз для ДАБ-21. Количество выходов в светлый рукав в группах диазепама и ДАБ-21 под влиянием флумазенила было снижено (табл. 1).

Таблица 1 Влияние введения флумазенила (1 мг/кг, в/ж) на поведение мышей в установке «Приподнятый крестообразный лабиринт» при введении соединения ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) и диазепама (2 мг/кг, в/ж), M ± SEM

*Данные достоверны по отношению к контролю (р « 0,05, критерий Краскелла - Уоллиса и пост-тест Данна).

При изучении стимулирующих эффектов фенамина длительность двигательной активности мышей, получавших фенамин (5 мг/кг, в/б), составила (1,60 ± 0,13) мин, а в группе ДАБ-21 (2,52 мг/кг, в/ж) - (3,50 ± 0,58) мин. Латентный период возникновения беспокойства был снижен с (5,40 ± 0,86) мин в группе контроля до (5,10 ± 0,40) мин в группе ДАБ-21. Длительность стереотипии в группе контроля (фенамина) составила (218,40 ± 24,05) с, в то время как в группе ДАБ-21 - (596,70 ± 3,80) с. По всем показателям теста «Фенаминовой стереотипии» для группы соединения ДАБ-21 показано статистически значимое увеличение уровня эффектов фенамина (р ^ 0,05).

В эксперименте «Клофелиновая гипотермия» ректальная температура мышей интактного контроля в начале теста составила (38,0 ± 0,04) °С, через 120 мин - (37,70 ± 0,16) °С. В группе мышей, получавших клофелин, ректальная температура упала с (38,10 ± 0,07) °С в начале эксперимента до (37,20 ± 0,10) °С через 120 мин, что статистически значимо отличается от показателей группы интактного контроля (р ^ 0,05). В группе ДАБ-21 показатель составил (37,90 ± 0,03) °С в начале теста и (37,50 ± 0,15) °С на 120-й мин. Не показано статистически достоверного различия ректальной температуры мышей, получавших ДАБ-21, с контрольной группой (р ^ 0,05).