Материал: Методическое пособие. Общая микробиология

а) реакция коагглютинации;

б) реакция латекс-агглютинации;

в) реакция агрегат-гемагглютинации (РАГА) и др.

10. Реакция преципитации. Получение бактериального гаптена и постановка реакции кольцепреципитации.

11. Реакция преципитации в геле (агаре) для определения:

а) природы антигена;

б) природы антител.

12.Реакция лизиса. Гемагглютинация, гемолиз.

13.Реакция связывания комплекса (РСК). Методика постановки РСК. Постановка основного опыта.

Методические указания

1. Приготовить корпускулярные антигены из культур водного вибриона и кишечной палочки. Для этого:

а) каждый студент получает одну пробирку с соответствующей культурой бактерий и проверяет её чистоту макро- и микроскопически; препарат-мазок окрасить по Граму;

б) приготовить взвесь бактерий в физиологическом растворе, стерильной пипеткой добавить в пробирку с культурой 5 мл физиологичес­кого раствора и, вращая пробирку между ладонями, смыть бактерий со среды;

в) с помощью стерильной пипетки перенести взвесь бактерий в стерильную пробирку и прогреть ее для умерщвления бактерий на водяной бане при температуре 70° в течение 30 минут для вибриона и 60 минут для кишечной палочки;

г) установить концентрацию бактерий во взвеси с помощью опти­ческих стандартов, после чего приготовить необходимое разведение антигена.

2. Методы иммунизации животных и получения иммунных сывороток:

а) демонстрация различных способов иммунизации животных: подкожный, внутривенный и внутрибрюшинный способы введения антигенов;

б) демонстрация различных способов получения крови от иммунизированных животных: взятие крови из вен у кролика и у лошадей, взятие крови из сердца у кролика и морской свинки.

3. Реакция агглютинации:

а) ориентировочная реакция на стекле. На чистое предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю агглютинирующей противовибрионной сыворотки в разведении 1:25 и рядом (другой пипеткой) каплю физиологического раствора (контроль антигена). В ту и другую каплю пастеровской пипеткой добавляют по 1-2 капли взвеси вибриона. Осторожно перемешивают петлей антиген вначале с физиологическим раствором, а затем с иммунной сывороткой (но не наоборот!). Чтобы ускорить наступление реакции агглютинации, предметное стекло, на котором производится опыт, рекомендуется слегка покачивать и очень осторожно подогревать высоко над пламенем спиртовки. Наблюдают за агглютинацией невооруженным глазом или пользуясь лупой. Реакция агглютинации более отчетливо видна, если смотреть на каплю снизу вверх. Феномен агглютинации проявляется образованием взвешенных хлопьев и просветлением жидкости в капле с сывороткой. В контроль ной капле (физиологический раствор) жидкость сохраняет свою равномерную гомогенную мутность;

б) реакция агглютинации в пробирке. В опыт берут две пробирки, специально используемые для реакции агглютинации. В одну из них добавляют 0,5 мл агглютинирующей сыворотки в разведении 1:25 (опыт), а в другую - 0,5 мл физиологического раствора (контроль антигена). Затем в обе пробирки добавляют по 0,5 мл соответствующего антигена, содержащего в I мл I млрд микробных тел. После перемешивания пробирки помещают в термостат на 2 часа при температуре 37⁰, после чего учитывают результат.

Реакция агглютинации на стекле: 1 – опыт; 2 – контроль

Вибрион Окраска по Граму

В опытной пробирке жидкость станет прозрачной (или почти прозрачной), а на дне пробирки выпадает осадок, который при встряхивании пробирки разбивается на свободно плавающие в жидкости хлопья. В контрольной пробирке жидкость сохранит равномерную и гомогенную мутность. При более длительном хранении пробирок (24 часа) в контрольной пробирке также может образоваться осадок, однако при встряхивании пробирок он разрушается и жидкость становится равномерно мутной.

Реакция агглютинации в пробирках: 1 – опыт; 2– контроль

4. Разбор методов приготовления 0- и Н-антигенов.

Реакция агглютинации на стекле с 0- и Н-антигенами. На чистое хорошо обезжиренное предметное стекло с помощью пастеровской пипетки наносят две капли сыворотки, содержащей 0- и Н-антитела. В одну аз них добавляют каплю антигена 0, в другую - каплю антигена Н. Антигены перемешивают с сыворотками (пользоваться разными петлями, или петлю прокаливать после перемешивания одной капли!). В капле, в которую был добавлен 0-антиген, образуется мелкозернистый осадок агглютинат, а в капле с Н-антигеном - крупнохлопчатый агглютинат.

5. Реакция гемагглютинации. На чистое стекло наносят пасте­ровской пипеткой каплю агглютинирующей сыворотки (полученной при иммунизации кроликов бараньими эритроцитами), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Затем в обе капли добавляют по одной капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки!). С помощью бактериальной петли перемеши­вают добавленные эритроциты сначала с физиологическим раствором, а затем с сывороткой (но не наоборот!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит только в опытной капле. Она наступает быстрее при покачивании стекла и осторожном подогревании.

В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит, так как там отсутствуют антитела.

Реакция агглютинации: 1 – О-агглютинация. 2 – Н-агглютинация.

Гемагглютинация: 1- Опыт. 2- Контроль.

6. Определение титра агглютинирующей сыворотки. Для опыта необходимо иметь:

а) агглютинирующую сыворотку против водного вибриона в исход­ном разведении 1:25;

б) взвесь убитых вибрионов (диагностикум: содержащий в I мл I млрд микробных тел);

в) физиологический раствор;

г) две пипетки емкостью I мл и 5 мл ;

д) штатив с набором из 8 агглютинационных пробирок.

Порядок работы

1) пронумеровать все пробирки;

2) разлить по 0,5 мл физиологического раствора во все пробирки, за исключением первой;

3) налить в первую и во вторую пробирки по 0,5 мл сыворотки в разведении 1:25;

4) перемешать сыворотку с физиологическим раствором во второй пробирке и перенести пипеткой (емкостью I мл) 0,5 мл в третью про бирку, после перемешивания 0,5 мл разведенной сыворотки переносится таким же образом из третьей пробирки в четвертую, из четвертой в пятую и т.д. до седьмой пробирки, из седьмой пробирки 0,5 мл жидкости удаляется. В восьмой пробирке сыворотки не должно быть. Она служит контролем антигена. После такого разведения сыворотки во все пробирки, но уже другой пипеткой, добавляют антиген по 0,5 мл. Пробирки энергично встряхивают вместе со штативом (для перемешивания антигена с антителом) и помещают в термостат при 37⁰ на 2 часа, после чего читают предварительный результат. Окончательный результат опыта регистрируют через 24 часа.

Результаты реакции агглютинации

	Контроль	Разведения сыворотки
		1:50	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200
Степень агглютинации

Вывод_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

7. Развернутая (пробирочная) реакция агглютинации ставится или с сывороткой больного (для определения в ней титра антител) или с диагностической сывороткой (для изучения антигенной структуры выделенного возбудителя). В том и другом случае дяя постановки опыта необходимы:

а) сыворотка больного в разведении 1:25 или диагностическая сы­ воротка в исходном разведении (или в сухом виде, тогда она разводится в отношении 1:25 или 1:50);

б) диагностикум - взвесь соответствующих известных убитых бак­терий в I мл I млрд микробных тел (для серологической диагностики) или взвесь исследуемых бактерий (для определения их антигенной структуры);в) физиологический раствор;

г) пипетки объемом I мл и 5 мл;

д) штатив с набором агглютинационных пробирок.

8. В настоящее время для диагностики многих заболеваний широко используется реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). Она основана на способности эритроцитов адсорбировать на своей поверхности специфические микробные антигены или антитела к ним. Сенсибилизированные таким образом эритроциты агглютинируются в присутствии гомологичных антител или антигенов. Для постановки реакции пассивной гемагглютинации необходимо иметь:

1. Сенсибилизированные эритроциты, или эритроцитарный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антигены возбудителя) или эритроцитарный антительный диагностикум (т.е. эритроциты, на которых адсорбированы антитела к микробным антигенам). Метод сенсибилизации эритроцитов зависит от вида возбудителя или природы антител.

2. Исследуемую сыворотку (сыворотку больного или бактерионоси­теля, в которой определяют наличие антител к возбудителю) или дру­гой материал от больного, в котором предполагается наличие возбудителя или его антигенов.

3. Физиологический раствор.

4. Соответствующие контрольные системы (заведомо положительные и заведомо отрицательные) для большей, специфичности диагноза.

Для постановки РПГА используют либо круглодонные агглютинационные пробирки одинакового диаметра либо специальные полистироло­вые пластинки с луночками.

Постановка опыта

Во все пробирки (луночки) разливают физиологический раст­вор: в 1-ю пробирку -0,9 мл, а в остальные - по 0,5 мл. Затем в 1-ю пробирку вносят 0,1 мл испытуемой сыворотки, перемешивают и пе­реносят 0,5 мл во 2-ю, вновь перемешивают и переносят из 2-й пробирки в 3-ю 0,5 мл и так далее до 7-й пробирки включительно. Из 7-й пробирки 0,5 мл жидкости выливают, 8-я пробирка служит контро­лем и поэтому сыворотки не содержит.

Эритроцитарный диагностикум перед использованием встряхивают до полного исчезновения осадка на дне и получения гомогенной взвеси. По ходу работы встряхивание часто повторяют. Эритроцитарный диагностикум разливают во все пробирки по 0,5 мл. после этого пробирки встряхивают и помещают на 1,5-2 часа в термостат при 37 °С, а затем учитывают результаты реакции (иногда через 16-20 часов).

Учет реакции производят по четырехкрестной схеме:

++++ полная гемагглютинация, эритроциты равномерно устилают почти все дно пробирки, нередко в виде зонтика;

+++ почти все эритроциты агглютинированы и равномерно покры­вают дно пробирки;

++ наряду с равномерным агглютинатом на дне пробирки имеется осадок в виде маленького колечка или "пуговки";

+ большинство эритроцитов осело в центре дна пробирки в виде диска и лишь незначительное количество агглютинировалось с образованием мелких хлопьев;

—признаков агглютинации нет: эритроциты осели в виде маленького колечка или "пуговки" (диска) в центре дна пробирки.

Титром испытуемой сыворотки считается последное ее разведение, которое дает ярко выраженную агглютинацию эритроцитов, не менее чем на +++.

Вариантами использования РПГА являются реакция нейтрализации антигена (рНАг), реакция нейтрализации антител (рНАт), реакция торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используются антигенные и антительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаймоконтролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с антигенным диагностикумом и рНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (рНАт) заключается в том, что суспензию, содержащую искомый антиген, смешивают со специфической иммуннойсывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эритроцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной температуре. Результаты учитывают через 3-4 часа и окончательно через 18-24 часа. Если в исследуемом материале имеется антиген, то он свяжет антитела (нейтрализует их) и поэтому гемагглютинации не произойдет.

По такому же принципу ставится реакция нейтрализации антигена (рНАг). Только в этом случае в исследуемом материале содержатся искомые антитела. Специфический антиген, добавленный к такому исследуемому материалу будет связываться с антителами, содержащимися в нем, т.е. произойдет нейтрализация антигена антителами и гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диагностикума не произойдет.

9. Одним из вариантов пассивной, т.е. опосредованной клетками-носителями антител, реакции агглютинации является коагглютинация. В основу этой реакции положено уникальное свойство стафилококков, имеющих в составе своей клеточной стенки белок А, связывать молекулы иммуноглобулинов классов Ig G и Ig M. Поскольку белок А взаимодействует с рецептором, который располагается на Fc - фрагменте молекулы антитела, его активные центры остаются свободными и могут взаимодействовать со специфическими детерминантами антигена.

Методика реакции.

На предметное стекло наносится капля 2% взвеси стафилококков, сенсибилизированных соответствующими антителами, добавляют каплю взвеси исследуемых бактерий, тщательно перемешивают. Результаты учитывают в течение 30-60 сек. и оценивают по 3-х крестной системе. При соответствии антигена антителам происходит четкая агглютинация нагруженных антителами стафилококков. Для контроля каплю взвеси стафилококков добавляют в каплю физиологического раствора. В контроле агглютинации не должно быть.

б) Реакция латекс-агглютинации (ЛАГ) также является чувствительным и специфическим методом диагностики. Основным условием успешной постановки ЛАГ является строгое соблюдение количественных соотношений компонентов системы при постановке реакции, выполняемой микрометодом, в лунках на стекле: к 50 мкл исследуемого материала добавляют 10 мкл латекс-препарата, частички которого несут на себе специфические антитела. После перемешивания смесь в течение 10 мин встряхивают. Результаты учитывают по 4-х крестной системе. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем двумя крестами. Всего на постановку реакции и ее учет тратится-около 30-40 мин. Специфичность ЛАГ оценивается с помощью трех контрольных тестов, содержащихся в коммерческих тест-системах (заведомо положительная реакция, заведомо отрицательная, контроль качества латекс-суспензии по ЛАГ несенсибилизированных, т.е. не несущих антител, латексов с исследуемым материалом. Все ингредиенты ЛАГ, включая контроля, входят в состав тест-системы. В качестве носителей специфических антител в нашей стране используются: полистироловые монодисперсные латексы с разными диаметрами частиц (0,3; 0,8; 0,66; 0,75 мкм).