Материал: Реакция связывания комплемента(теория)

•ферменты; используются в реакции иммуноферментного анализа (ИФА);

•радиоактивные изотопы; используются в реакции радиоиммунного анализа (РИА)

•электронно-плотные белки; используются в иммуноэлектронной микроскопии. Реакции ставят в двух направлениях:

-для определения неизвестного антигена;

-для определения неизвестных антител.

Используют прямые и непрямые методы. Непрямой метод заключается в выявлении комплекса антиген-антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, имеющей метку.

РИФ (метод Кунса)

В реакции используют люминесцентные сыворотки, антитела которых обработаны флюорохромом. Такие меченые АТ называют конъюгатом. На практике используют флюорохромы, имеющие желтую, желто-зеленую и красную флюоресценцию в ультрафиолетовых лучах.

Различают три основные варианта метода: прямой, непрямой, с комплементом.

Прямой метод основан на применении специфических сывороток, АТ которых метятся флюорохромами. При взаимодействии таких АТ с соответствующими АГ образуется специфический светящийся комплекс, видимый в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Этот метод используют только для определения антигена, т.е. обнаружения бактерий в мазках и выявления вирусов в зараженных клетках.

Рис. 4. Схема реакции прямой (а) и непрямой (б) иммунофлюоресценции .

Чаще применяют непрямой метод (РНИФ). Для выявления неизвестного АГ в исследуемом материале готовят фиксированный мазок из антигена, обрабатывают его антимикробной кроличьей специфической сывороткой, промывают, а затем на этот препарат наносят антиглобулиновую (антикроличью) сыворотку, меченую флюорохромом. Образуемый в результате комплекс имеет свечение в люминесцентном микроскопе, как при прямом методе. Непрямой метод используют также для выявления специфических АТ в исследуемой сыворотке. В этом случае применяют антиглобулиновую сыворотку против Ig человека.

Определение специфических АТ с помощью РНИФ широко применяется для диагностики заболеваний, передающихся половым путем, является основным методом диагностики геморрагической лихорадки с почечным синдромом.

Антикомплементарная РИФ предполагает применение меченых антител против комплемента морской свинки. Используется только в тех случаях, когда комплекс антигенантитело способен фиксировать комплемент. При добавлении к такой системе антикомплементарной меченой сыворотки также наблюдается специфическое свечение образовавшегося комплекса в люминесцентном микроскопе.

РИФ применяют в качестве экспресс-диагностики: гриппа, парагриппа, аденовирусной, ротавирусной, коронавирусной, герпесвирусной инфекций, паротита, кори, бешенства, сифилиса, гонореи, дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллеза,холеры, бруцеллеза, чумы, сибирской язвы, туляремии, микоплазмоза и других инфекционных заболеваний.

Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА)

ИФА основан на реакции АГ-АТ с применением конъюгатов, состоящих из АТ, меченых ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой и др.). Используется для выявления АГ и АТ.

Иммуноферментный метод проводят в два этапа. На первом происходит взаимодействие АТ с АГ, на втором – ферментативная индикация образовавшегося комплекса.

Основными достоинствами этого метода являются:

•высокая чувствительность, позволяющая определять вещества в минорных концентрациях: 10-10 – 10-12 г/л;

•доступность для обычных диагностических лабораторий (экспрессивность и автоматизация этапов реакции);

•возможность использования минимальных объемов исследуемого материала (1-2 мкл). Существуют разные модификации этого метода: прямой, непрямой, жидкофазный,

твердофазный, конкурентный.

Наиболее распространен твердофазный ИФА, когда один из компонентов иммунной реакции (АГ или АТ) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. При определении АТ в сыворотке больных в лунки с адсорбированным на дне антигеном последовательно добавляют сыворотку больного, затем антиглобулиновую сыворотку, меченую ферментом, и смесь растворов субстрата для фермента и индикатор. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания. При наличии в сыворотке больного АТ образуется комплекс АГАТ, который выявляется с помощью антиглобулиновой меченой сыворотки. АТ этой сыворотки присоединяются к комплексу, при этом активизируется фермент, расщепляющий субстрат и меняется цвет среды в лунке, что свидетельствует о положительной реакции. Изменение цвета в лунках оценивается визуально и с помощью спектрофотометра: увеличение интенсивности окраски пропорционально количеству сорбированных на антигене специфических антител.

Рис. 5. Схема твердофазного иммуноферментного анализа:

а – определение антител больного в лунках планшетов с адсорбированным антигеном;

б – определение антигена в лунках планшетов с адсорбированными диагностическими антителами *

ИФА является одним из наиболее распространенных специфических методов диагностики многих инфекционных заболеваний бактериальной, грибковой, протозойной этиологии и, особенно вирусной. В частности его применяют для диагностики ВИЧ-инфекции, гепатитов А,В,С,D,E,G, респираторных, герпесвирусных и других инфекций, а также для определения гормонов, ферментов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале.

Иммуноблотинг (ИБ)

В практической диагностике вирусных инфекций иногда существует необходимость определять спектр специфических АТ. Для этого используют иммуноблотинг (от анл. blot – пятно) – высокочувствительный метод, сочетающий электрофорез и ИФА. Принцип этого метода основан на выявлении АТ к отдельным АГ возбудителя. ИБ используется как диагностический метод при ВИЧ-инфекции.

Антиген возбудителя разделяют на белковые фракции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. В настоящее время эту процедуру не проводят, а используют коммерческие тест-системы – фирменные полоски с готовыми к исследованию «блотами» АГ. На эти полоски (стрипы) наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся АТ и наносят антиглобулиновую (против Ig человека) сыворотку, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске специфический комплекс выявляют добавлением хромогена (субстрата для фермента). При этом в местах соответствия АГ-АТ образуются пятна, что соответствует

Рис. 6. Схема иммуноблотинга

обнаружению специфических АТ. Результаты ИБ оценивают как положительные, сомнительные и отрицательные в зависимости от количественного и качественного набора выявленных антител.

Иммуноблотинг используют при герпесвирусной инфекции, вирусных гепатитах и других инфекциях.

Радиоиммунный анализ (РИА)

Это высокочувствительный метод, основанный на реакции АГ-АТ с применением АГ или АТ, меченых изотопной меткой (125J, 14C, 3H и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся комплекс и определяют его радиоактивность в счетчиках импульсов. Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул АГ и АТ.

Используют несколько вариантов метода: прямой, непрямой, твердофазный, конкурентный. Конкурентный метод РИА используют для выявления антигена гепатита В (HBV) у больных. Для этого к исследуемой сыворотке добавляют известную противовирусную сыворотку (анти-HBV). Смесь инкубируют 1-2 дня, затем добавляют HBV, меченый радиоактивным йодом, инкубируют ещё 1 сутки, затем вносят антиглобулиновую сыворотку к анти-HBV, что приводит к образованию преципитата. Образующийся при этом преципитат помещают в счетчик изотопов, и, поскольку он не содержит метки, изотопы не определяются. Диагноз в данном случае положительный. Если вируса в сыворотке нет, известная противовирусная сыворотка соединяется с вирусом гепатита В, меченым изотопом йода. Тогда в преципитате, образующимся под действием антиглобулиновой сыворотки, будет присутствовать радиоактивная метка, которую и выявляет счетчик. Диагноз в этом случае будет отрицательный.

РИА применяют для выявления микробных антигенов, гормонов, ферментов и др. Чувствительность метода 10-10 ─ 10-12 г/л. Метод используется ограниченно в связи с экологической опасностью.